M13 Molekulare Physiologie Prof. Dr. Thorsten Mascher Dr. Diana Wolf Jara Radeck Philipp Popp Susanne Krause

Montag, Promoter-PCRs ansetzen 1. PCR für LFH ansetzen PCRs aufreinigen PCRs auf Agarosegel analysieren Verdau der PCR- Produkte berechnen Verdau des Vektors berechnen Ablaufplan, M13, 2015 Dienstag, PCR auf Agarosegel analysieren 1. PCR aufreinigen Konzentration bestimmen 2. PCR für LFH „Joining“ berechnen 2. PCR für LFH „Joining“ ansetzen

Polymerasekettenreaktion (PCR) PCR-Ansatz: Was muss alles rein?

Wie sehen bakterielle Promotoren aus? Promoter: spezifische DNA-Sequenz, an die die RNA-Polymerase vor der Transkription bindet. Wie sieht solch eine Promoter-Sequenz bei Bakterien aus? Merkmale?

P liaI P bceA fwd rev Promotoren zur Klonierung liaI Primer: TM4746 (PliaI-fwd EcoRI) + TM2896 (PliaI-rev SpeI) 400 bp fwd rev bceA yvqJ Primer: TM3044 (PbceA-fwd EcoRI) + TM3045 (PbceA-rev SpeI) 398 bp yvqJ bceS Primer: TM2781 (PpsdA-fwd EcoRI) + TM2782 (PpsdA-rev SpeI) P psdA P lepA fwd rev psdA yvqJ 600 bp psdS fwd rev lepA yvqJ 157 bp yqxA Primer: TM2899 (PlepA-fwd EcoRI) + TM2900 (PlepA-rev SpeI) Gruppe Gruppe Gruppe Gruppe 4 + 8

P bcrC P uppS fwd rev Promotoren zur Klonierung bcrC Primer: TM4740 (PbcrC-fwd BsaI) + TM4741 (PbcrC-rev SpeI) 400 bp fwd rev uppS yvqJ Primer: TM4742 (PuppS-fwd EcoRI) + TM4743 (PuppS-rev SpeI) 418 bp glnK frr P yubA P uppP(yubB) fwd rev yvqJ 386 bp yulF Primer: TM4738 (PyubA-fwd EcoRI) + TM4739 (PyubA-rev SpeI) fwd rev uppP (yubB) 418 bp Primer: TM4744 (PuppP-fwd EcoRI) + TM4745 (PuppP-rev SpeI) yubA Gruppe Gruppe Gruppe Gruppe 4 + 8

„Long-Flanking-Homology“-PCR- 1.Teil Amplifikation der „up“ und „down“ Fragmente der zu deletierenden Gene: rev bcrC glnK ywnJ fwd rev fwd „up“ „down“ 1067 bp 1039 bp Gruppe Primer: TM0352+TM0353 (up) TM0354+TM0355 (down) rev uppP yubA cdoA fwd rev fwd „up“ „down“ 782 bp 826 bp Gruppe Primer: TM4749+TM4750 (up) TM4751+TM4752 (down) rev yubA yulF uppP fwd rev fwd „up“ „down“ 743 bp 826 bp Gruppe Primer: TM4747+TM4748 (up) TM4751+TM4752 (down) cdoA

„Long-Flanking-Homology“-PCR- 1.Teil Amplifikation der Kanamycin- und Macrolid-Lincosamid-Streptogramin (MLS)- Resistenzkassette: Resistenzkassetten sind spezifisch für B. subtilis etabliert (Guerout-Fleury et al., Gene (1995)) Resistenzkassetten sind auf Plasmiden lokalisiert  Plasmide werden als DNA- Template genutzt Gruppe 1, 2, 6, 7+8  Kanamycin-Resistenzkassette - pDG1513 als Template - Primer TM TM Größe: 1479 bp Gruppe 3, 4, 5  (MLS)-Resistenzkassette - pBS1E als Template - Primer TM TM Größe: 1113 bp mls fwd rev kan fwd rev

Restriktionsverdau Prinzip des Restriktionsverdaus: gezieltes „Zerschneiden“ von DNA durch Restriktionsenzyme (Restriktionsendonukleasen) Nomenklatur der Restriktionsendonukleasen: z.B. EcoRI  Escherichia coli RI 13, „I“ = Nummerierung Restriktionsenzyme erkennen spezifische Sequenzabschnitte  Palindrome Die Spaltung der DNA führt zu „sticky ends“ oder „blunt ends“ G ▼ AATT C C TTAA ▲ G „sticky ends“ EcoRI A ▼ CTAG T T GATC ▲ A SpeI AGT ▼ ACT TCA ▲ TGA ScaI „blunt ends“

Restriktionsverdau Sonderfall  Verdau von P bcrC mit BsaI Warum?  EcoRI Schnittstelle innerhalb des Promoters Wie?  „Simulieren“ einer EcoRI Schnittstelle durch Verdau mit BsaI GGTCTC(N) 1 ▼ CCAGAG(N) 5▲ BsaI  Anfügen der Sequenz für BsaI und EcoRI am P bcrC -fwd Primer GGTCTCG ▼ AATT C CCAGAGC TTAA ▲ G BsaI-Schnittstelle mit EcoRI Erkennungssequenz

Restriktionsverdau Berechnung der Enzymmenge: MW (R)Molekulargewicht der Referenz-DNA (Ad2-DNA = 35,9 kb) MW (x)Molekulargewicht der zu verdauenden DNA in kb n (R)Anzahl der Schnittstellen für das Enzym in der Referenz-DNA n (x) Anzahl der Schnittstellen in der zu verdauenden DNA Beispielrechnung für P uppS -Verdau (0,5 µg) mit EcoRI (20 U/µl): 17 U/µg DNA 8,5 U für 500 ng DNA Doppelte Menge einsetzen: 17 U  0,85 µl Enzym für Verdau

Restriktionsverdau Eigenschaften der im Praktikum eingesetzten Enzyme: EcoRI-HF (20 U/µl, CutSmart-Puffer) SpeI-HF (20 U/µl, CutSmart-Puffer) BsaI (10 U/µl, CutSmart-Puffer) Für Verdau werden die jeweiligen Enzyme mit der zu verdauenden DNA, Puffer und Wasser gemischt  Doppelverdau (= 2 Enzyme pro Ansatz) Jeweils einen Ansatz für die Promotoren und einen Ansatz für den Vektor pBS3Clux (10649 bp)

Mittwoch, Ablaufplan, M13, 2015 Donnerstag, Verdau der PCR- Produkte ansetzen Verdau des Vektors ansetzen 2. PCR auf Agarosegel analysierenVerdau auf Agarosegel analysieren Klonierung (Ligation) Verdau aufreinigen Konzentration bestimmen Übernachtkultur von B. subtilis W168 ansetzen Transformation von B. subtilis W168 Transformation von E. coli DH5α Freitag, Colony-PCR PCRs auf Agarosegel analysieren Colony-PCR PCRs auf Agarosegel analysieren Positive Klone überimpfen (Platte u. ÜN) Positive Klone überimpfen (Platte u. ÜN plus W168)

Auswertung der 2. LFH-PCR (Joining) Beispielbild für Joining-PCR mit verschiedenen Resistenzkassetten

Verdau ~ 1100 bp SpeI EcoRI ~ 9500 bp

Ligation pBS3Clux Promoter Neues Plasmid EcoRI (BsaI) EcoRI SpeI

Promoter pBS3Clux

Berechnen des Ligationsansatzes Wichtig: das Volumen des Ligationsansatzes so gering wie möglich halten (~ ca. 10 µl) Jede Gruppe setzt die Ligation mit eigenen Promotoren und Vektor an sowie mit Vektor von uns (  Warum das?) Material für die Ligation: Verdauter pBS3Clux-Vektor (200 ng) Verdautes Promoter-Fragment (3-fach molarer Überschuss) Ligationspuffer (10x) Ligase Wasser zum Auffüllen 3-fach molarer Überschuss an Promoter-Fragment????? X = Menge (ng) mal 3 (3-fach mehr) = Menge an DNA, die für die Ligation eingesetzt werden muss

Montag, Promoter-PCRs ansetzen1. PCR für LFH ansetzen PCRs aufreinigen PCRs auf Agarosegel analysieren Verdau der PCR- Produkte berechnen Verdau des Vektors berechnen Ablaufplan, M13, 2015 Dienstag, PCR auf Agarosegel analysieren 1. PCR aufreinigen Konzentration bestimmen 2. PCR für LFH „Joining“ berechnen 2. PCR für LFH „Joining“ ansetzen

„Long-Flanking-Homology“-PCR- 2.Teil Teil 1  Teil 2  Joining-PCR = „Zusammenführen“ von up-Fragment-Resistenzkassette-down-Fragment Fragmente und Kassetten dienen als Template: up: ng down: ng Kassette: ng Joining-PCR läuft in zwei Schritten ab: Schritt 1 ohne Primer, Schritt 2 mit Primer

A BioBrick1 EXSP A BioBrick2 EXSP Cut with E&S Cut with X&P BioBrick1 EXS 5‘ -- A 3‘ -- TGATC SpeI CTAGA -- 3‘ T -- 5‘ XbaI BioBrick2 XS P EcoRI XbaI SpeI PstI Compatible ends, no recognition site! -- ACTAGA –- -- TGATCT -- EX S P M BioBrick1 BioBrick2 The universal BioBrick cloning standard

Vectorsluciferase reporter vectors

Mittwoch, Ablaufplan, M13, 2015 Donnerstag, Klon 1 der ÜN-Kultur animpfen TMB2841 und W168 animpfen Theoretische Planung und Vorbereitung des „Plate-Reader“-Assay Praktische Durchführung des 1. „Plate-Reader“-Assay Klon 2 als ÜN-Kultur animpfen TMB2841 und W168 als ÜN-Kultur animpfen Klon 2 der ÜN-Kultur animpfen TMB2841 und W168 animpfen Theoretische Planung und Vorbereitung des „Plate-Reader“-Assay Praktische Durchführung des 2. „Plate-Reader“-Assay Auswertung des 1. „Plate-Reader“- Assay Auswertung am Freitag, Mikroskopie Sequenzanalyse

Mikrotiterplatten-Assay Mikrotiterplatten-Aufteilung: Platte 1 Gruppe 1 Gruppe 2Gruppe 7 Reihe A-HReihe A-HReihe A-H Spalte 1-4Spalte 5-7Spalte 8-11 Spalte 12 mit H 2 O füllen Platte 2 Gruppe 4Gruppe 5Gruppe 6Gruppe 8 Reihe A-HReihe A-HReihe A-HReihe A-H Spalte 1-3Spalte 4-6Spalte 7-9Spalte 10-12

Mikrotiterplatten-Assay Beladungsschema: Spalten 1234 (Gruppe 1+7) A H2OH2OStamm A, KlonI Stamm E, KlonI B H 2 O; bacStamm A, KlonI; bac Stamm E, KlonI; bac C LBStamm B, KlonI Stamm E, KlonI D LB; bacStamm B, KlonI; bac Stamm E, KlonI; bac E W168Stamm C, KlonI Stamm F, KlonI F W168; bacStamm C, KlonI; bac Stamm F, KlonI; bac G TMB2841Stamm D, KlonI Stamm F, KlonI H TMB2841; bacStamm D, KlonI; bac Stamm F, KlonI; bac Reihen

Cryokulturen GruppeStämme 1 A: WT PliaI B: WT PuppP C: uppP::MLS PliaI D: uppP::MLS PuppP E: uppP::MLS PbceA F: uppP::MLS PyubA TMB3411 TMB3412 TMB3413 TMB3414 TMB3415 TMB A: WT PbceA B: WT PyubA C: YubA-uppP::MLS PbceA D: YubA-uppP::MLS PyubA TMB3417 TMB3418 TMB3419 TMB A: uppP::MLS PlepA B: uppP::MLS PuppS C: bcrC::kan PlepA D: bcrC::kan PuppS TMB3421 TMB3422 TMB3423 TMB A: yubA-uppP::MLS PpsdA B: yubA-uppP::MLS PbcrC C: uppP::MLS PpsdA D: uppP::MLS PbcrC TMB3425 TMB3426 TMB3427 TMB A: yubA-uppP::MLS PliaI B: yubA-uppP::MLS PuppP C: bcrC::kan PliaI D: bcrC::kan PuppP TMB3429 TMB3430 TMB3431 TMB A: WT PpsdA B: WT PbcrC C: bcrC::kan PpsdA D: bcrC::kan PbcrC E: bcrC::kan PbceA F: bcrC::kan PyubA TMB3433 TMB3434 TMB3435 TMB3436 TMB3437 TMB A: yubA-uppP::MLS PlepA B: yubA-uppP::MLS PuppS C: WT PlepA D: WT PuppS TMB3439 TMB3440 TMB3441 TMB3442

Cryokulturen Noch mehr Cryokulturen für die folgenden Gruppen (AARGGHHH!!!):  Gruppe 4: uppP::MLS = TMB 3408  Gruppe 6: bcrC::kan = TMB3410  Gruppe 8: yubA-uppP::MLS = TMB3409 Wie wird die Cryokultur gemacht?  900µl 50% Glycerol + 900µl Kultur in 2 ml Cryoröhrchen mischen. STERIL arbeiten!!! Wie beschriften?  Deckel: Nummer (ohne TMB) und „I“ für Klon I  Tube: Cryo-Label mit Datum, Gruppennummer, Stammhintergrund (W168 oder z.B. uppP::MLS) und Promoter (z.B. PliaI-lux); Klon I beschriften  Label auf Cryoröhrchen kleben und nochmal mit Tesafilm umkleben