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Veröffentlicht von:Kilian Franke Geändert vor über 8 Jahren
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Chemisch-Analytische Methoden in der Pflanzenphysiologie
Qualitative Analytik nennt man Nachweis Aufgabe der (Bio)Chemischen Analytik ist die quantitative Bestimmung von Stoffen (Analyten) Spurenanalytik (Kleinstmengenanalyse) Test (halbquantitative Analyse)
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Verfahren, Methode, Prinzip
Unter- suchungs- Objekt Proben- nahme Vor- bereitung Messung Aus- wertung Analytische Information Prinzip Analysemethode Analyseverfahren
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Kriterien zur Beurteilung einer Methode
Spezifität (Selektivität) Empfindlichkeit (Nachweisgrenzen) Genauigkeit & Reproduzierbarkeit (accuracy & precision)
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Selektivität Selektivität hängt von möglichen Störungen durch andere Probe-Inhaltsstoffe ab. Abtrennung von störenden Stoffen spezifischere Methoden Begriff: Matrix!
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Empfindlichkeit S = m.c + SL Nachweisgrenze: N = SL + 3.StabL
Fähigkeit der Methode zwischen kleinen Differenzen in der Konzentration des Analyten zu unterscheiden abhängig von der Steigung der Kalibrationsgeraden Nachweisgrenze: S = m.c + SL N = SL + 3.StabL
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Genauigkeit & Reproduzierbarkeit
Genauigkeit (accuracy) sagt aus, wie nahe ein Meßwert dem tatsächlichen Wert kommt Reproduzierbarkeit (precision) sagt aus wie übereinstimmend wiederholte Messungen sind
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Systematischer & Zufälliger Fehler
gut schlecht Systematischer Fehler gut schlecht Genauigkeit Reproduzier- barkeit optimal
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Die Kalibration Prozess, mit welchem man die Gerätewerte
mit den absoluten Mengen der zu bestimmenden Substanz in Übereinstimmung bringt. Leerwerte (blanks) Standards (externe, interne) Kalibrationsbereich Kontrollen
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Leerwerte Leerwert ist Matrix ohne Analyt
Nullpunktbestimmung für jedes analytische Gerät notwendig Man unterscheidet: - Reagenzienleerwerte (z.B. Photometrie) - Blindwerte (Grundwert, z.B. Enzymatik)
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Standards Proben bekannter Konzentration, die man zur Kalibrierung einer Methode einsetzt, nennt man Standards! Standards sollten in Matrix hergestellt sein. Externe Standards: die zu bestimmende Substanz wird chemisch rein eingesetzt Interne Standards: eine ähnliche Substanz, die man zusetzt und die als Bezugsgröße verwendet wird
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Kalibrationskurve Kalibrations- punkte Nichtlineare Kalibrationskurve
Arbeitsbereich Nichtlineare Kalibrationskurve
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Kalibration 1. Leerwert 2. Standards 3. Proben
M + R Messung Instrumenten- Auf Null stellen Anzeige 2. Standards S1 + M + R Messung Instrumenten- Kalibrations- S2 + M + R Anzeige kurve 3. Proben P1 + M + R Messung Instrumenten Werte- P2 + M + R Anzeige berechnung M, Matrix; R, Reagentien; S1, Standard 1; P1, Probe 1.
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Kontrollen Um eine Methode zu überprüfen sollte regelmäßig eine Probe bekannter Konzentration gemessen werden. Biologische Referenzmaterialien Schwierig bei Methoden die keine pool-Größen messen, sondern Prozesse (etwa Enzymaktivitäten)
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Berechnungen 1: Konzentrationen
Masse (kg) c = m / v (Konzentration = Masse / Volumen) z.B.: mg L-1, µg cm-3, mg mL-1, etc Stoffmenge (Mol) c = n / v (molare Konzentration = Mol / Volumen) z.B.: mol L-1 (M), mmol L-1 (mM), µmol mL-1 (mM), µmol L-1 (µM)
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Berechnungen 2: Verdünnungen
! das Produkt aus Konzentration mal Volumen vor der Verdünnung entspricht dem Produkt nach der Verdünnung! Cvor x Vvor = Cnach x Vnach z.B.: Aus einer 1M KCl-Lösung soll 250 mL einer 20mM Lösung hergestellt werden. 1M x X = 0.02M x 250 mL X = (0.02 x 250) / 1 = 5 mL Lösung: 5 mL einer 1M KCl sind notwendig um 250 mL einer 20 mM Lösung herzustellen
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Berechnungen 3: Verdünnungsfaktor
Z.B.: 10-fache Verdünnung (1 zu 10, 1:10) 1 mL auf 10 mL bedeutet 1 mL + 9 mL oder 1 mL in einem Gesamtvolumen von 10 mL Mischt man also gleiche Volumina miteinander hat man eine Verdünnung von 1:2 (nicht 1:1!).
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Werteangaben (signifikante Stellen)
Beispiel: Waage zeigt g an. Die letzte Stelle ist unsicher! Der wahre Wert kann also zwischen und mg liegen.
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Werteangaben 2 Beispiel:
Meßwerte — mg Calcium, 2.11 g Pflanzenmaterial 5.4366 5.4092 Jeder Wert zwischen und ist möglich. Der Wert kann also nicht als 5.42 angegeben werden (Grenzwerte ), sondern nur als 5.4 mg g-1 (Grenzwert 5.35 und 5.44).
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Praktische Hinweise Chemikalien Wasserqualitäten Wägen Zentrifugation
Volumsmessungen
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Chemikalien Gefahrensymbole
Qualitäten p.a. (pro analysis), zur Synthese, ACS, OEAB, chemisch rein, Suprapur, Biochimica select Beschriftungen von abgefüllten Chemikalien Inhalt, Konzentration, Datum, Benutzer Giftig Mindergiftig Ätzend Explosions Brand Hoch/Leicht Reizend gefährlich fördernd Entzündlich
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Chemikalien
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Wasserqualitäten Demineralisiertes Wasser Geschirrspüler (Reversosmose, Hausleitung) Deionisiertes Wasser Abwaschen, (Ionentaustauscherpatrone, allg. Labor) anorg. Analytik Destilliertes Wasser Enzymaktivitäten (Quarzdestillationsanlage) Milli Q-Wasser Reinstwasser, (Reinstwasser >18.2 MOhm cm-1) Chromatographie
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WÄGEN Wägebereich der Waage beachten!
Störungen: Offene Türen, Heizung, Erschütterungen Nivellieren (Libelle) und Kalibrieren (Auto) Wägegefäß sollte möglich klein sein Statische Aufladungen vermeiden (kein Kunststoff) Mitte der Waagschale (Ecklasteffekt) Waage vorbelasten (Erstwägeeffekt) Indirekte Handhabung (Zange; T- und RH-Effekte) Wägegut sollte Umgebungstemperatur haben
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Einflüsse beim Wägen Temperatur Luftfeuchte T+ T- Wägegut
erscheint leichter Wägegut erscheint schwerer Verdunstung erscheint leichter Wasseraufnahme erscheint schwerer
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Zentrifugation Relative Beschleunigung (x g) statt Drehzahl (rpm)
Max. Drehzahl beachten Bremsen (je nach An- wendung) Austarieren der Gefäße Beladung: - 2 x gegenüber (180°) - 3 x im Winkel 120°
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Volumsmessung (auf Wägungen zurückführbar)
Glaspipetten (Ex, 20°, ± 1%) Voll-, Meß-, Präszisionspipetten Luftpolsterpipetten Meßzylinder Büretten Dispensoren Meßkolben (In!) Enghals, Weithals
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