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Der EPO-Rezeptor und seine Funktionen. Das ‘Janus-Gesicht’ der Tumorhypoxie Schlüsselbotschaft Die überwiegende Mehrzahl hypoxischer Tumorzellen leiden.

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1 Der EPO-Rezeptor und seine Funktionen

2 Das ‘Janus-Gesicht’ der Tumorhypoxie Schlüsselbotschaft Die überwiegende Mehrzahl hypoxischer Tumorzellen leiden unter diesen Folgen. Ein kleiner Teil (< 5%?) der Zellen zeigt jedoch ein ganz anderes Verhalten, sie bestimmen das Schicksal des Krebspatienten. Hypoxie Verringerte Proliferation Differenzierung Apoptose Nekrose Adaptive Prozesse Aggressiver Phänotyp Tumorprogression Erworbene Therapieresistenz

3 Eine Hypoxie führt zur Selektion eines Phänotyps aggressiver Tumorzellen Anämie Hypoxie Resistenz gegen Chemotherapie Chemotherapie und Bestrahlung Selektionsdruck  Genominstabilität  Adaptationsvorgänge  Maligne Progression Negative Beeinflussung des langfristigen Ergebnisses Schlechte Durchblutung

4 Teufelskreis von Tumorhypoxie und maligner Progression Veränderungen der Genexpression Proteomveränderungen (< 1% O 2 ) Tumor- förderung Maligne Progression  Aggressivität Genomveränderungen (< 0,1% O 2 ) Klonselektion Tumorhypoxie (feindliche Mikroumgebung) Tumorhypoxie/Anämie: – verstärkt die Aggressivität des Tumors – verstärkt die Therapie- resistenz – verkürzt die Überlebenszeit – vermindert die lokale Kontrolle Vaupel et al. In: Nowrousian MR, ed. Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO) in Clinical Oncology. Berlin, Springer, 2002:127–46.

5 Es gibt einen optimalen Oxygenierungsstatus innerhalb eines geschlechtsspezifischen cHb-Bereichs Oxygenierungsstatus als Funktion der Hämoglobinspiegel (cHb) Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66. Vaupel et al. Strahlenther Onkol Medianer pO 2 (mmHg) Karzinome im HNO-Bereich n=142 Durchschnitt +/- SEM cHb (g/dl) Karzinome der Zervix uteri n=104 Durchschnitt +/- SEM cHb (g/dl) Medianer pO 2 (mmHg)

6 Oxygenierungsstatus als Funktion des Hämoglobinspiegels Vaupel et al. Cancer Res 2003;63:7634–7. Medianer pO 2 (mmHg) Hb (g/dl) Normale Mamma Mammakarzinome (5) (3) (5) (8) (3) (9) (7)(7)

7 Tumoroxygenierung und Überleben Zeitraum (Monate) Gesamt-Überlebenswahrscheinlichkeit Log-Rank p = 0,0039 Zervixkarzinom Alle behandelten Patientinnen (n = 89) Medianer pO 2 ≥ 10 mmHg (n = 41) Medianer pO 2 < 10 mmHg (n = 48) Höckel et al. Cancer Res 1996;56:4509–15.

8 Oxygenierung von normalem Gewebe und Tumoren im HNO-Bereich Normaler Hb-Wert Leichte Anämie Hb F: 11,0–11,9 g/dL M: 11,0–12,9 g/dL Mäßige/starke Anämie (Hb <11 g/dl ) 50 0 Gewebe-pO 2 (mm Hg) Normalgewebe (M. sternocleidom.) Tumor Normalgewebe kann eine leichte Anämie kompensieren; Tumoren können dies nicht p < 0,0001 Tumoren im HNO- Bereich Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66.

9 Maximale Tumoroxygenierung im Hb-Bereich zwischen 12,2 und 14,4 g/dl Hb (g/dl) Zeit (Wochen) Placebo EPO Henke (2003) HNO Becker (2000), Vaupel (2002) Plattenepithelkarzinom Medianer pO 2 (mmHg) Henke (2003) RT –Studie lag über diesem Wert Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66. Henke et al. Lancet 2003;362:1255–60. Vaupel et al. In: Nowrousian MR, ed. Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO) in Clinical Oncology. Berlin, Springer, 2002:127–46.

10 Anämie, Hypoxie und Ergebnis einer Bestrahlung Die Entwicklung einer Tumorhypoxie steht mit einer Anämie im Zusammenhang (Hb <13 g/dl) 1,2 Hypoxische Regionen sind bei soliden Tumoren aufgrund einer unzureichenden Blutversorgung und hohem intratumoralem Sauerstoffverbrauch häufig. Molekularer Sauerstoff scheint hoch reaktive Hydroxylradikale, die eine DNA-Schädigung vermitteln, zu stabilisieren Zum Abtöten von Zellen ist unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu Normalbedingungen das 2,5- bis 3,5-Fache der Standard-Bestrahlungsdosis erforderlich. 1. Brizel et al. Radiother Oncol 1999;53:113– Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66.

11 Zusammenfassung zur Tumoroxygenierung Nur für Anstiege der Hb-Werte, die zu einer Verbesserung der Tumoroxygenierung führen, ist eine günstige Auswirkung auf die Prognose zu erwarten. Bei höheren Hb-Werten (Hb >14 g/dl) ist ein erheblicher Anstieg der viskösen Resistenz innerhalb der chaotischen Mikrogefäße zu erwarten, was zu einer Nettoreduktion der Sauerstoffzufuhr führt (schlechte Tumoroxygenierung) Nur Anstiege bis zu den gegenwärtig empfohlenen Hb-Werten führen zu Verbesserungen der Tumoroxygenierung, was die Prognose verbessern kann.

12 Rekombinante Epoetine verschlechtern die Wirksamkeit einer CT bei Krebs nicht Ergebnisse In Mammakarzinom-Zelllinien –Eine EPO-Therapie beeinträchtigte die antiproliferativen und/oder zytotoxischen Wirkungen von Adriamycin, Taxol und Tamoxifen nicht Bei Mäusen –Durch Zugabe von EPO zu Paclitaxel wurde das Therapieergebnis nicht beeinflusst LaMontagne et al. Mol Cancer Ther 2006;5:347–55. Gewirtz et al. Clin Cancer Res 2006;12:2232–38. Proliferation (% der Kontrollen ) Keine Proliferation (% der Kontrollen) Keine

13 Kenntnisse über den EPO-Rezeptor Offene Fragen –Gibt es auf Tumorzellen EPO-Rezeptoren? –Ist der EPO-Rezeptor auf Tumorzellen funktionsfähig? –Können ESA in vivo den EPO-Rezeptor auf Tumorzellen stimulieren?

14 EPO-Rezeptoren (EPO-R) auf menschlichen Tumoren? Indirekte Belege 1,2 –Elimination von IHC-Färbung des Tumors bei vorheriger Resorption von EPO-R –In klinischen Studien lassen sich eine Verringerung des lokoregionalen PFS oder des Gesamtüberlebens in der mit ESA behandelten Gruppe beobachten Direkte Belege 3 –Demonstration eines EPO-R-Effekts in Tumorzelllinien oder Tumorproben mit polyklonalen Antiseren von Kaninchen (IHC) –Förderung des Tumorzellwachstums und/oder Therapieresistenz in vitro 1. Osterborg et al. Eur J Cancer 2007;43:510–9. 2. Lai et al. J Clin Oncol 2006;24:4675–6. 3. Sinclair et al. Cancer 2007;110:477–88. IHC = Immunhistochemie.

15 Rekombinantes Epoetin ist nicht mit einem Tumorwachstum assoziiert Präklinische Studien Untersuchung der EPO-Rezeptor-Expression und Auswirkung einer Therapie mit rekombinanten Epoetinen auf das Tumorwachstum Ergebnisse In Mammakarzinom-Zelllinien –Es wurde eine EPO-Rezeptor-Expression nachgewiesen –Es war keine spezifische Bindung von Epoetin an den Rezeptor zu beobachten, was darauf hinweist, dass der EPO-Rezeptor nicht funktionsfähig ist –Eine Epoetin-Therapie führte nicht zu Tumorwachstum Epoetin löste keine physiologische Reaktion des Tumors aus (Proliferation, Migration, Signaltransduktion) LaMontagne et al. Mol Cancer Ther 2006;5:347–55. Gewirtz et al. Clin Cancer Res 2006;12:2232–38.

16 Präklinische Studien zur Auswirkung von ESA auf menschliche Tumoren Die Mehrzahl der in-vitro- und in-vivo-Studien zeigte eine neutrale Auswirkung In einigen wenigen in-vitro- Studien zeigte sich eine gewisse Auswirkung auf die Proliferation und/oder Apoptoseresistenz –Suprapharmakologische Konzentration von ESA –Nicht statistisch signifikant; synchronisierte Zellen –Nicht konsistent, was positive/negative Kontrollen betrifft –Keine eindeutigen Belege für intrazelluläre Signalgebung Osterborg et al. Eur J Cancer 2007;43:510–9.

17 Präklinische Daten deuten nicht auf eine Bedeutung von EPO-R für die Tumorprogression hin Das EPO-R-Gen ist kein Onkogen, und eine Überexpression dieses Gens bringt für Tumoren keinen Selektionsvorteil EPO-R-mRNA-Spiegel sind in Tumorzelllinien nachweisbar, im Vergleich zu nicht tumorösen Geweben aber nicht erhöht Tumorzelllinien zeigen eine schwache oder nicht nachweisbare EPO- Bindung Eine Oberflächenexpression von EPO-R auf Tumoren wurde nicht zweifelsfrei gezeigt In den meisten klinischen Modellen zeigen sich verbesserte Ergebnisse (keine Tumorprogression in 23 unabhängigen Studien) Sinclair et al. Cancer 2007;110:477–88.

18 Henke et al. J Clin Oncol 2006;24:4708–13. Zusätzliche Analyse einer Studie mit Bestrahlung ± EPO bei Karzinomen im HNO-Bereich EPO-R (unter Verwendung von C20 - Antiserum) korrelierte in der EPO-Studie mit einem schlechten Ergebnis –Seren von 154 oder 351 Originalprobanden –2/3 exprimierten EPO-R Rezeptoraktivität nicht untersucht, nur Expression –EPO-R-Expression lässt sich ohne Signaltransduktion zeigen –HSP70-Kontrollen wurden nicht vorgestellt (falls durchgeführt) ‘Validierte’ eine Hypothese mit dem gleichen Datensatz, der zu ihrer Formulierung gebraucht wurde Sehr große Fehlerwahrscheinlichkeit für Beta-Fehler in der ‘EPO-R-negativen’ Gruppe Korrelation von EPO-R und EPO mit schlechtem Ergebnis?

19 Welche weiteren möglichen Erklärungen gibt es? Anämie Hypoxie Chemotherapie-ResistenzBestrahlungsresistenz Selektionsdruck  Genom-Instabilität  Angiogenese  Maligne Progression Negative Auswirkungen auf das langfristige Ergebnis Vaupel et al. Med Oncol 2001;18:243–59.

20 Kommerzielle polyklonale Anti-EPO-R- Antikörper sind nicht spezifisch und weisen multiple Proteine nach EPOR Elliott et al. Blood 2006;107:1892–5. Leerer Vektor

21 Hitzeschockprotein 70 (HSP70) Sehr gut erhaltene Familie von Chaperon-Proteinen, die in normalen Zellen durch Stress induziert werden und wichtige Funktionen für das Überleben der Zelle und die Apoptoseresistenz haben Die Expression wird bei vielen menschlichen Tumoren verstärkt –Die Expression korreliert bei vielen Tumorarten (Bronchien, Mamma, HNO, Prostata, Darm, Magen, Blase) mit einem kürzeren Überleben und einer Therapieresistenz –Die Expression wird unter hypoxischen Bedingungen verstärkt –Eine Hinunterregulierung (z.B. Antisense) induziert den Tod von Tumorzellen Homologe Sequenz mit Antigen, das zur Bildung von polyklonalen Antikörpern C20 verwendet wird (insbesondere HSP70-2 und HSP70- 5) Viele der ‘EPO-R’, die mit C20 nachgewiesen werden, könnten auch HSP70-2 oder HSP70-5 sein Schmitt et al. J Leukoc Biol 2007; 81:15–27.

22 Zusammenfassung der Datenlage: ESA sind nicht mit Tumorwachstum/Proliferation assoziiert Präklinische und klinische Daten sprechen nicht für die Hypothese, eine ESA-Therapie führe zu Tumorwachstum/-proliferation Der Antikörper, der zum Nachweis des EPO-Rezeptors verwendet wird, ist unspezifisch und weist auch das Hitzeschockprotein 70 nach ( HSP70-2, HSP70-5) In Modellen heterologer Transplantate wurde EPO-R auf der Plasmamembran von Tumorzellen nicht funktionell exprimiert In keiner Studie zeigte sich, dass pharmakologisch relevante ESA- Dosen das Tumorzellwachstum stimulieren ESA hatten keinen negativen Einfluss auf die Zytotoxizität einer CT Erythropoetin war nicht proangiogen und verstärkte die Metastasenentstehung nicht Laufende Studien werden Informationen zur Funktion von EPO-R bei Tumoren liefern

23 Zusammenfassung: Kenntnisse über EPO-R Offene Fragen Gibt es auf Tumorzellen EPO-R? Rezeptoren lassen sich mit Hilfe eines unspezifischen Antikörpers auf Tumorzellen nachweisen –EPO-R und HSP-70 haben sehr ähnliche Strukturen Ist der EPO-R auf Tumorzellen funktionsfähig? Es gibt keine Belege dafür, dass EPO-R oder HSP-70 durch ESA aktiviert werden Können ESA in vivo EPO-R auf Tumorzellen stimulieren? Es gibt keine Belege dafür, dass ESA innerhalb der zugelassenen Anwendungsgebiete bei Patienten mit CT Tumorzellen stimulieren

24 Kontrolle der Erythropoetin-Synthese Verlust des Gleichgewichts Normaler Sauerstoffgehalt Verlust des Gleichgewichts Stimulus: Hypoxie aufgrund von verminderter Erythrozytenzahl, verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff im Blut oder gesteigertem Sauerstoffbedarf der Gewebe Erhöhung des Sauerstoff- gehalts des Plasmas Verringert den Sauerstoffgehalt des Plasmas Niere: Freisetzung von Erythropoetin Erythropoetin stimuliert das Knochenmark Gesteigerte Erythropoese erhöht die Erythrozytenzahl

25 Veränderungen der endogenen Plasmakonzentrationen von Erythropoetin und Hb-Anstiege Modified from Al-Huniti et al. J Pharmacol Exp Ther 2004;310:202–8. Hämoglobin Endogenes Erythropoetin Hb g/dl Tage EPO mIU/ml

26 Liganden-induzierte Dimerisierung des EPO-R und nachfolgende Interaktion mit und Aktivierung von JAK2 JAK2: Januskinase 2 Damen et al. EMBO J 1995; 14:5557–68. Klingmuller et al. Cell 1995;80:729–38. Extrazellulär Plasma- membran Intrazellulär

27 EPO-R-Aktivierung und Signaltransduktion Damen et al. EMBO J 1995;14:5557–68. Klingmuller et al. Cell 1995;80:729–38 Inaktiver monomerischer Rezeptor Dimerischer Rezeptor und JAK2-Aktivierung Gen- transkription Beendigung der Signalgebung

28 Internalisierung und Abbau des EPO-R-Komplexes Modified from Walrafen et al. Blood 2005;105:600–8. Erythropoetin Ubiquitin Phospho- tyrosin Intrazelluläre Signalgebung

29 Elliott et al. Blood. 2000;96(abstract 352). Die Bindungsaffinität für Epoetin alfa ist 4-mal höher als für Darbepoetin Bindungsaffinität von Epo alfa Bindungsaffinität sinkt IC 50 für die EPO-Rezeptor-Bindung (pM) Epoetin alfa Darbepoetin alfa


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