Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Mikrobielle Ökologie der Phyllosphäre Dr. Norman Mauder Lehrstuhl für Botanik II Universität Würzburg.

Ähnliche Präsentationen


Präsentation zum Thema: "Mikrobielle Ökologie der Phyllosphäre Dr. Norman Mauder Lehrstuhl für Botanik II Universität Würzburg."—  Präsentation transkript:

1 Mikrobielle Ökologie der Phyllosphäre Dr. Norman Mauder Lehrstuhl für Botanik II Universität Würzburg

2 Gliederung Einleitung – Definitionen Wie kommen Bakterien in die Phyllosphäre? Was tun epiphytische Bakterien? Welche Untersuchungsmethoden wendet man an?

3 Einleitung – Definitionen Phyllosphäre [griechisch], die von Mikroorganismen (Bakterien, Pilzen) besiedelte Oberfläche der Blätter und Blattscheiden. (Brockhaus, Meyers Lexikon) The term phyllosphere was coined by Last (1955) and Ruinen (1956) to describe the plant leaf surface as an environment that is physically, chemically and biologically distinct from the plant leaf itself or the air surrounding it. The term phylloplane has been used also, either instead of or in addition to the term phyllosphere. (Johan H.J. Leveau, 2006, in Biology of the Plant Cuticle)

4 Einleitung – Definitionen Epiphyten [grch. epi = auf, über; phyton = Pflanze], Organismen (Bakterien, einzellige und filamentöse Pilze, Pflanzen), die auf Pflanzenoberflächen überleben und wachsen können(, ohne der Pflanze damit zwangsläufig zu schaden). microbial epiphytes or epiphytic microorganisms, which include bacteria, fungi and yeasts, are defined as being capable of surviving and thriving on plant leaf and fruit surfaces. (Johan H.J. Leveau, 2006, in Biology of the Plant Cuticle)

5 Gliederung Einleitung – Definitionen Wie kommen Bakterien in die Phyllosphäre? Was tun epiphytische Bakterien? Welche Untersuchungsmethoden wendet man an?

6 Populationsdynamik – Immigration Wie kommen Bakterien auf die Blattoberfläche? Während des Pflanzenwachstums, von Samenoberfläche und aus dem Boden Aus der Luft –Wind –Staubpartikel –Regen –Aerosole –Insekten 10 m Luft über einer Grasfläche enthält durchschnittlich 121 CFU/m 3 bis 1,4×10 3 CFU/m 3 jahreszeitliche, tageszeitliche und kurzzeitige (2 min) Fluktuationen (Lighthart & Shaffer, 1995) Immigration von durchschnittlich 11 Pseudomonas syringae pro Tag und Bohnenblatt an einem regenfreien Tag, Insekten übertragen von ~0 bis 10 4 Bakterien pro Kontakt (Upper & Hirano, 2002)

7 Populationsdynamik – Emigration Wie verschwinden Bakterien von der Blattoberfläche? Wichtigster Faktor: Regen –Hydrophobizität der Oberfläche –Oberflächenbeschaffenheit ('Lotuseffekt'!) Bei Regen werden in 15 min im Schnitt 10 5 Bakterien von einem Bohnenblatt gespült (Lindemann & Upper, 1985)

8 Wie verändern sich epiphytische Bakterienpopulationen? Dynamik ist Summe von Immigration, Wachstum, Absterben und Emigration Faktoren: –Regen –Luftfeuchtigkeit –UV Strahlung –Blattalter –Pflanzenart (Heuer & Smalla, 1997) –Insekten (Stadler & Müller, 2000) –CO 2 Konzentration (Magan & Baxter, 1996) –Luftverschmutzung (Brighigna et al., 2000) –saurer Regen (Helander et al., 1993) –Position des Blattes (Andrews et al., 1980; de Jager et al., 2001) Populationsdynamik Regen führt zu starker Vermehrung von epiphytischen Bakterien, evtl. wegen erhöhter Nahrungsverfügbarkeit aufgrund von 'Leaching' (Hirano & Upper, 2000) Niedrige relative Luftfeuchte führt zu abnehmenden Populationsdichten und Veränderungen in der Artenvielfalt (OBrien & Lindow, 1989; Hirano & Upper, 2000). Bohnenblätter haben bei Hitze und Trockenheit hauptsächlich PPFMs (pink pigmentierte fakultativ methylotrophe Bakterien), während bei feuchtem, warmen Wetter Pseudomonas syringae dominiert (Hirano & Upper, 2000). UV Exposition kann die bakterielle Diversität der Phyllosphäre erhöhen (Kadivar & Stapleton, 2003). Bakterien sind im Allgemeinen die Erstbesiedler eines jungen Blattes, später dominieren Hefen, und schließlich übernehmen filamentöse Pilze das alternden Blatt (Blakeman, 1985).

9 Gliederung Einleitung – Definitionen Wie kommen Bakterien in die Phyllosphäre? –Populationsdynamik (Immigration, Wachstum, Sterben, Emigration) Was tun epiphytische Bakterien? Welche Untersuchungsmethoden wendet man an?

10 Was Epiphyten tun, hängt davon ab, was sie können müssen, um zu überleben. Fitness: 'to fit' = 'passen', aber wohinein oder wozu? Umwelt ist die Blattoberfläche epiphytische Fitness – 'Epiphitness'

11 Die Oberfläche der Kutikula ist eine unwirtliche Umgebung: –Wasserstress –geringe Nahrungsverfügbarkeit –UV-Strahlung (95% UV-A (320–400 nm), 5% UV-B (290–320 nm)) –schneller Wechsel dieser Bedingungen, sogar innerhalb der Verdopplungszeit Umwelt - Blattoberfläche

12 Bakterien sind mal kleiner als Menschen, ein Blatt ist für sie eine äußerst heterogene Landschaft: –Grüne Bohne: adaxiale Seite besteht zu 74% aus undifferenzierten Epidermiszellen, 17 % Stomata, 7 % Adern und 1 % Trichome; Unterschiede in Durchlässigkeit für Wasser und andere Pflanzenstoffe (Monier & Lindow, 2004) –Trichome können eine Reihen von Pflanzenstoffen sekretieren: Zucker, Proteine, Öle, Sekundärmetabolite, Schleim –Wasserverfügbarkeit: Regen, Nebel, Tau, Wasseransammlungen an hygroskopischen Salzkristallen oder an den Stomata (Burkhardt et al., 1999) –Temperatur ändert sich im Tagesverlauf, kann aber auch auf einem Blatt vom Zentrum zum Rand variieren (Verdunstungskälte, Wasserverfügbarkeit) –Nähe zu anderen Epiphyten: Konkurrenz um Nahrung und Platz Möglichkeit zur Kooperation und zum horizontalen Gentransfer (Austausch von Plasmiden) Interaktion zwischen Bakterien, Hefen und Pilzen weitestgehend unbekannt Umwelt - Blattoberfläche

13 Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen? Adhäsion an Oberfläche –Fimbrien/Pili (bei Gram-negativen Bakterien) –Produktion einer (klebrigen) Matrix (Exopolysaccharide: z.B.: Alginat, Succinoglycan, Xanthan, Zellulose) 'Epiphitness'

14 Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen? Adhäsion an Oberfläche Schutz vor Austrocknung –Exopolysaccharide zur Ausbildung eines feuchten Mikroklimas –Leben in der Nähe von Trichomen mit Wasserreservoirs Schutz vor UV-Licht –schützende Pigmentierung gegen UV-Strahlung (Goodfellow et al., 1976; Dickinson, 1986; Lindow & Brandl, 2003; Jacobs et al., 2005) –Reparaturmechanismen bei DNA Schäden (Kim & Sundin, 2000; Sundin et al., 2000; Zhang & Sundin, 2004) –Leben in der Nähe von schattenspendenden Strukturen (z.B. Trichome) –Ausweichen ins Innere der Pflanze (Pathogene) 'Epiphitness'

15 Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen? Adhäsion an Oberfläche Schutz vor Austrocknung Schutz vor UV-Licht Verwertung von Nahrung 'Epiphitness'

16 Kutikula: Kutin Polymer, Wachse mit hoher Kohlenstoff- und Energiedichte... bisher kein Beweis dafür, dass Komponenten der Kutikula von Mikroorganismen zum Wachstum verwendet werden (Beattie, 2002) Pollen, Honigtau, Staub, Luftverschmutzung, Bruchstücke von Mikroben (Stadler & Müller, 2000; Leveau, 2004) 'Leaching' von Pflanzenmetaboliten aus dem Inneren an die Oberfläche –passiver Vorgang –stimuliert durch Wasser auf dem Blatt (Regen, Nebel) –häufigste Substanzen: Glucose, Fructose, Sucrose Limitierende Größe für die Population der Mikroorganismen ist die C-Quelle (Zucker), nicht die P- oder N-Quelle (Wilson & Lindow, 1994a; Wilson et al., 1995; Mercier & Lindow, 2000) Andere C-Quellen: Methanol und Methylamine (PPFMs!) (Holland & Polacco, 1994), sowie Indol-3-Essigsäure (Leveau & Lindow, 2005) Spurenelemente: Bakterien benötigen z.B. Siderophore zur Eisenbeschaffung (Loper & Buyer, 1991) 'Epiphitness' – Ernährung, Nahrungsquellen eine Zelle Erwinia herbicola benötigt 0,3 pg Zucker für eine Verdopplung (Leveau & Lindow, 2001) Epiphyten-freie Bohnen im Gewächshaus haben 0,2–10 µg Zucker/Blatt (durchschnittlich 2,5 µg), genug für 10 7 Bakterien pro Blatt (Mercier & Lindow, 2000)

17 Ernährungsweisen der verschiedenen epiphytischen Mikroorganismen sind sehr unterschiedlich... einerseits im Spektrum der möglichen Nahrungsquellen: –'nutritional niche overlap index' zum Vergleich zweier Epiphyten (Wilson & Lindow, 1994a; Ji &Wilson, 2002) –niedriger Index: Spezies verwenden unterschiedliche Quellen, Koexistenz möglich andererseits in ihrer Affinität: –hohe Affinität: Organismen können Nährstoffe auch bei sehr niedrigen Konzentrationen verwerten auch Aufteilung in K- und r-Strategen (Andrews, 1984) : –K-Strategen reproduzieren langsamer und sind erfolgreich unter Bedingungen mit limitierten Ressourcen –r-Strategen wachsen sehr schnell und dominieren bei abundanten Ressourcen 'Epiphitness' – Ernährung, Konkurrenz

18 Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen? Adhäsion an Oberfläche Schutz vor Austrocknung Schutz vor UV-Licht Verwertung von Nahrung Modifikation ihrer Umwelt 'Epiphitness'

19 Modifikation der biologischen Nische: Produktion von IAA (Indol-3-Essigsäure) (Brandl et al., 2001) oder des Phytotoxins Syringomycin (Lindow & Brandl, 2003) durch epiphytische Mikroorganismen stimuliert u.U. die Freisetzung von Nährstoffen durch die Pflanze Verringerung der Hydrophobizität der kutikulären Oberfläche, z.B. durch die Bildung von Surfactants (surface active agents) (Bunster et al., 1989), kann Blattfeuchtigkeit erhöhen, was zu 'Leaching' von Nährstoffen führt (Knoll & Schreiber, 2000) Bildung extrazellulärer Polysaccharide zur besseren Adhäsion, Schutz vor Austrocknung, Einfangen von Nährstoffen, Barriere gegen chemische, biologische oder anderen Umweltstressfaktoren, oder als Matrix für Kommunikation über kleine diffusible Moleküle wie z.B. AHLs (N-Acyl- Homoserinlactone, bei Proteobakterien) Antibiose: –einige epiphytische Hefen produzieren antibakterielle Substanzen (McCormack et al., 1994) –antimykotischen Aktivitäten bei epiphytische Bakterien (Giesler & Yuen, 1998; Nair et al., 2002; Collins et al., 2003; Daayf et al., 2003) 'Epiphitness' – Modifikationen

20 Epiphitnessgene > Pathogenitätsgene Pathogene: –Pseudomonas und Erwinia Arten verursachen Frostschäden durch Bildung biologischer Eiskeime (Lindow, 1983) –ina Gene kodieren für Proteine die als Eiskeime fungieren können, und sind bei P. syringae, P. fluorescens, E. herbicola, E. ananas, Xanthomonas campestris und anderen zu finden –Erwinia: einige Arten verursachen nekrotische oder Welke-Krankheiten, andere verursachen Weichfäulen; bewegliche Stäbchen Feuerbrand (fire blight), Erwinia amylovora, Nord-Amerika, Europa Bakterien-Naßfäule (soft rot), Erwinia carotovora, Weltweit –Pseudomonas: abgegrenzte Fäulen, z.B. Blattflecken und Brände; viele produzieren in Kulturen ein grünliches, wasserlösliches Pigment; bewegliche Stäbchen 'Epiphitness' – Pathogenität

21 Pathogene: –Xanthomonas: Blattflecken und Brände; kleine, bewegliche Stäbchen –Clavibacter (Corynebacterium): einziges Gram-positives Pflanzenpathogen, verursacht systemische Infektionen mit Gallenbildung, Ringfäulen und Welken; dünne, lange Stäbchen, unbeweglich 'Epiphitness' – Pathogenität Erkrankungen ausgelöst durch Xanthomonas campestris auf Broccoli (oben) und Pfeffer (rechts)

22 Was muss ein mikrobieller Epiphyt können, um zu überleben und zu wachsen? Adhäsion an Oberfläche Schutz vor Austrocknung Schutz vor UV-Licht Verwertung von Nahrung Modifikation ihrer Umwelt –Pathogenität Interaktion mit anderen Epiphyten 'Epiphitness'

23 Interaktion zwischen Epiphyten: Kommunikation: –viele pflanzenassoziierte Bakterien produzieren Quorum Sensing Signale (AHLs) (Cha et al., 1998) zur indirekten Bestimmung der Populationsdichte und dichteabhängigen Kontrolle der Genexpression (Juhas et al., 2005) Genaustausch: –Viele bakterielle Epiphyten tragen Plasmide (Kobayashi & Bailey, 1994; Sundin et al., 2004) –zusammen mit Transposons bilden diese den 'horizontalen Genpool' (Bailey et al., 2002) –dieser Genpool enthält Gene für Epiphitness, Virulenzfaktoren (Sundin et al., 2004), sowie Antibiotikaresistenz (z.B. gegen Tetracyclin, das in Apfelgärten gesprüht wird (Schnabel & Jones, 1999) ) –Kutikuläre Oberflächen sind Hotspots für Genaustausch und gelten als breeding grounds for microbial diversity (Lindow & Leveau, 2002) –Plasmidtransferraten auf Bohnenblattoberflächen sind 30-fach höher als auf Polycarbonatfiltern (Normander et al., 1998) 'Epiphitness' – Interaktionen

24 Gliederung Einleitung – Definitionen Wie kommen Bakterien in die Phyllosphäre? –Populationsdynamik (Immigration, Wachstum, Sterben, Emigration) Was tun epiphytische Bakterien? –Epiphitness Umwelt (Blattoberfläche) Anpassung Welche Untersuchungsmethoden wendet man an?

25 Methoden – Probennahme von Bakterien Blattabdrücke –stark vom verwendeten Medium abhängig –Selektion durch Antibiotika (Cycloheximid, Penicillin) oder bestimmte Nahrungsquellen –Vorteile: einfach –Nachteile: geringe Auflösung, keine echte Quantifizierung möglich, keine quantitative Entfernung der Bakterien

26 Blattwaschung (Vortexen, Ultraschall)... und Ausplattieren –stark vom Medium abhängig –Selektion durch Antibiotika (Cycloheximid, Penicillin) oder bestimmte Nahrungsquellen –Vorteile: Quantifizierung möglich, Einzelkolonien –Nachteile: Quantifizierung ist Fehler-behaftet durch untersch. Wachstumsgeschwindigkeit, Aggregatbildung, unterschiedliche Resistenz gegen Abwaschung Methoden – Probennahme von Bakterien

27 Mazeration (mechanisch: Mörser, Kugelmühle, etc.) –Vorteil: quantitative Entfernung der Organismen –Nachteil: Endophyten werden mitgezählt Gefriertechnik (eigentlich entwickelt für Wachsanalyse) –Vorteil: quantitative Entfernung der Organismen –Nachteil: tödlich für viele Organismen, deshalb... –Quantifizierung über die gewonnene DNA-Menge (qRT-PCR)! (Heuser & Zimmer, 2002) Quantifizierung erfolgt pro Blatt, pro Blattgewicht oder pro Blattoberfläche –logarithmierte Zahlen, weil keine Normalverteilung, sondern log-normale Allgemeine Probleme: –nicht alle Bakterien sind kultivierbar, Unterschied VPNC (viable but not culturable) und CFU (colony forming unit); auf Blättern 75% VPNC (Wilson & Lindow, 1992), andere Habitate nur ~1 Promille CFUs! –untersuchtes Blatt ist zerstört oder zumindest Bakterienpopulation ist zerstört Methoden – Probennahme von Bakterien

28 Elektronenmikroskopie –höchste Auflösung, aber Gefahr der Artefaktbildung Methoden – Mikroskopie Krimm, 2005

29 DNA Färbung (berichtet von Kepner & Pratt, 1994) –Acridinorange (bindet an DNA und RNA, Anregungsmaximum ~470 nm, gefärbte einzelsträngige Nukleinsäuren emittieren orange-rote Fluoreszenz, doppelsträngige eher grün –DAPI ((Anregung mit 365 nm) interkaliert nicht, DNA-spezifisch, an DNA gebunden fluoresziert es blau oder blau-weiß (~390 nm), ungebunden gelblich) Methoden – Mikroskopie

30 Methoden – DAPI-Färbung Krimm, 2005

31 DNA Färbung (berichtet von Kepner & Pratt, 1994) –Acridinorange (bindet an DNA und RNA, Anregungsmaximum ~470 nm, gefärbte einzelsträngige Nukleinsäuren emittieren orange-rote Fluoreszenz, doppelsträngige eher grün –DAPI ((Anregung mit 365 nm) interkaliert nicht, DNA-spezifisch, an DNA gebunden fluoresziert es blau oder blau-weiß (~390 nm), ungebunden gelblich) –Propidiumiodit (färbt tote Zellen, leuchtet rot) GFP (grün fluoreszierendes Protein) exprimierende Bakterien –Reportergene, Beispiel: Fruktose-sensitiver Promotor Methoden – Mikroskopie

32 Methoden – GFP als Reportergen Krimm, 2005

33 DNA Färbung (berichtet von Kepner & Pratt, 1994) –Acridinorange (bindet an DNA und RNA, Anregungsmaximum ~470 nm, gefärbte einzelsträngige Nukleinsäuren emittieren orange-rote Fluoreszenz, doppelsträngige eher grün –DAPI ((Anregung mit 365 nm) interkaliert nicht, DNA-spezifisch, an DNA gebunden fluoresziert es blau oder blau-weiß (~390 nm), ungebunden gelblich) –Propidiumiodit (färbt tote Zellen, leuchtet rot) GFP (grün fluoreszierendes Protein) exprimierende Bakterien –Reportergene, Beispiel: Fruktose-sensitiver Promotor Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) –Vorteil: hohe Spezifität, Identifizierung der Organismengruppe je nach Wahl der Sonde Methoden – Mikroskopie Yersinia ruckeri Yersinia pestis Yersinia enterocolitica unterschieden mittels FISH

34 Methoden – ribosomale DNA und RNA rDNA ist in allen Lebewesen vorhanden rRNA liegt in hoher Kopienzahl vor (bei Stoffwechsel-aktiven Zellen, ca Ribosomen) es gibt konservierte und variable Bereiche sehr große Datenbank verfügbar (>70,000 Sequenzen in Genbank) Ribosom von Haloarcula marismortui mit der kleinen 30 S Untereinheit (links, 16 S rRNA (orange) und Proteine (blau)) und der großen 50 S Untereinheit (rechts, 23 S rRNA (orange), 15 S rRNA (gelb) und Proteine (blau))

35 D/TGGE Denaturierende/Temperatur-Gradienten Gelelektrophorese erlaubt kulturunabhängige Analyse der Abundanz und Diversität einer mikrobiellen Gemeinschaft Sequenz-Unterschiede bis zu einer einzelnen Base DNA-Gemisch GC-reicher Überhang Primer für kons. rDNA Region Amplifikat-Gemisch je ~500 bp PCR

36 D/TGGE Amplifikat-Gemisch Temperatur / Denat. Agens Konz. (Formamid)

37 D/TGGE (Yang et al., 2001)

38 D/TGGE Ergebnisse: bei den leicht kultivierbaren Bakterien dominieren die Gattungen Pseudomonas, Erwinia und Xanthomonas, noch häufiger ist jedoch oft Methylobacterium, wenn man Methanolplatten verwendet Analyse der 16S RNA aus Blattwaschungen: –5 der 17 rRNA Sequenzen zeigten weniger als 90% Ähnlichkeit zu den nächst verwandten Spezies in den Datenbanken, was darauf hindeutet das es sich um noch unbeschriebene taxonomische Gruppen handelt (Yang et al., 2001) –auf Grüner Bohne (Phaseolus vulgaris), Baumwolle (Gossypium hirsutum), Zuckerrübe (Beta vulgaris) und Orangen (Citrus spp.) ähneln sich die bakteriellen Populationen auf verschiedenen Individuen der gleichen Pflanzenart, sind aber untereinander verschieden (Yang et al., 2001)


Herunterladen ppt "Mikrobielle Ökologie der Phyllosphäre Dr. Norman Mauder Lehrstuhl für Botanik II Universität Würzburg."

Ähnliche Präsentationen


Google-Anzeigen