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Grundlagen der Blutgerinnung Teil 2 Gerinnungstests in der Routine.

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Präsentation zum Thema: "Grundlagen der Blutgerinnung Teil 2 Gerinnungstests in der Routine."—  Präsentation transkript:

1 Grundlagen der Blutgerinnung Teil 2 Gerinnungstests in der Routine

2 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 22 Hämostaseuntersuchungen Primäre Hämostase Blutungszeit Thrombozytenaggregationstest Thrombozytenfunktion Sekundäre Hämostase Bestimmung von Gerinnungs- und Fibrinolysefaktoren und –inhibitoren Globaltests: Quick, aPTT, Thrombinzeit Bestimmung von Einzelfaktoren und Inhibitoren

3 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 23 Blutentnahme Kurze Stauung weitlumige Kanüle (0,6 – 1 mm) Erste Entnahme nicht für Gerinnung Zügige Entnahme ohne Hämolyse Geeignetes Antikoagulanz (meist Citrat 1:10) Sofort mischen (ohne Schaumbildung) Proben bei RT lagern, bald ins Labor bringen

4 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 24 Probenvorbereitung Innerhalb von 2 Stunden nach Entnahme zentrifugieren (bei Routineuntersuchungen) Thrombozytenarmes Plasma: 10 min., 1500 – 2000 g = ca U/min Thrombozytenfreies Plasma: 20 min., mind g = 4000 U/min Thrombozytenreiches Plasma 5 min., 100 g = 800 U/min

5 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 25 Probenvorbereitung Aufbewahrung bei RT bis zur Untersuchung (max. 4 Stunden für Globaltests) Höhere Temperaturen, auch Sonneneinstrahlung führen zu Aktivitätsabfall Lagerung im Kühlschrank führt zu Kälteaktivierung der Faktoren VII, XI und XII Probe für spätere Untersuchungen schnellstens einfrieren Einfrieren bei -70°C oder schockgefrieren (-196°C) Kurzfristige Lagerung bei -20°C (2 Wochen) Längerfristige Lagerung bei -70°C (1 Jahr) Praktisch unbegrenzte Haltbarkeit bei -196°C

6 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 26 Messprinzipien Koagulometrische Messverfahren Messung der Gerinnungszeit bis zur Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin Mechanisches Prinzip mit Hilfe von Kugeln Optisches Prinzip durch Messung der Zunahme an Trübung oder Lichtstreuung Chromogene Messverfahren Messung der (Enzym-)Aktivität von Faktoren oder Inhibitoren mit Hilfe chromogener Substrate Immunologische Messverfahren Bestimmung der Konzentration mit Hilfe von spezifischen Antikörpern (Enzymimmunoassays)

7 Primäre Hämostase Blutungszeit Thrombozytenaggregationstest Thrombozytenfunktion

8 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 28 Blutungszeit Einziger in-vivo-Test zur Erfassung der Thrombozytenfunktion Nur bedingt standardisiert Erhebliche Fehlerquellen Zeit- und personalaufwändig Geeignet in definierten klinischen Situationen Bekannte Thrombopathie (z.B. Morbus Glanzmann) Bei Einnahme von ASS u.ä. Medikamenten

9 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 29 Blutungszeit Methode nach Duke Stichverletzung am Ohrläppchen, abtupfen des austretenden Blutes, messen der Zeit bis zum Blutungsstillstand. Methode nach Ivy Nach Anlegen einer Stauung von 40 mmHg am Oberarm wird mit einem speziellen Einmalgerät ein Schnitt am Unterarm gesetzt. Das austretende Blut wird abgetupft und die Zeit bis zum Blutungsstillstand gemessen.

10 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 210 Thrombozytenaggregationstest Zugabe von aggregationsinduzierenden Substanzen zu plättchenreichem Plasma Kollagen Adrenalin ADP Ristocetin Erhöhung der Lichtdurchlässigkeit bei Aggregatbildung (Messung in speziellem Photometer, Aggregometer) Aufzeichnen der Lichtdurchlässigkeit (Aggregation) als Kurve

11 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 211 Thrombozytenaggregationstest Normale Aggregation alle Kurven grenzwertig Vermindert bis grenzwertige Aggregation

12 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 212 Platelet Function Analyzer (PFA-100) Messung der Plättchenfunktion bei hohen Scherkräften und ersetzt weitgehend die Blutungszeit Citratblut strömt durch die kapilläre Öffnung einer mit Kollagen und ADP (oder Kollagen und Epinephrin) beschichteten Membran. Die Zeit von Testbeginn bis zum Verschluss der Öffnung wird gemessen = Verschlusszeit (CT = closure time) beschichtete Membran Kapillaröffnung Kapillare Probenreservoir Probe

13 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 213 Platelet Function Analyzer (PFA- 100) Einflussgrößen Thrombozytenzahl Thrombozytenfunktion Blockierung von GP Ib und GP IIb/IIIa Angeborene Defekte Medikamentöse Blockierung der Rezeptoren Von-Willebrand-Faktor Medikamente hemmend: ASS, Rheopro u.ä. fördernd: DDAVP, Substitution des von-Willebrand- Faktors

14 Sekundäre Hämostase Quick PTT Thrombinzeit Fibrinogen Einzelfaktoren Antithrombin III D-Dimere

15 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 215 Gerinnungskaskade VerletzungVerletzungVerletzung Fremdoberfläche XIXIaIXIXa + VIIIa + PL + Ca ++ VIII XIIXIIa PK, HMWK Thrombozyten-PLX Xa + Va + PL + Ca ++ V IFibrin s IIIIa XIIIa Fibrin i XIII Gewebsthromboplastin Gewebs-PL, TF Ca ++ + PL + VIIaVII Intrinsisches Sytem Extrinsisches Sytem Gemeinsame Endstrecke

16 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 216 Quick-Test = Thromboplastinzeit (TPZ) Globaltest für das extrinsische System und die gemeinsame Endstrecke der Gerinnung. Erfasst werden: Vitamin-K-abhängige Faktoren II (Prothrombin), VII und X Faktor V und Fibrinogen (Faktor I) Inhibitoren (z.B. Heparin in hoher Konzentration) X Xa + Va + PL + Ca ++ V IFibrin s IIIIa Ca ++ + PL + VIIaVIIGewebsthromboplastin Gewebs-PL, TF

17 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 217 Quick-Test Prinzip: Durch Zugabe von Gewebethromboplastin und Calcium wird die Gerinnung über das extrinsische System ausgelöst. Die Zeit von der Zugabe des Reagenzes bis zur Gerinnselbildung wird gemessen (TPZ). Mit Hilfe einer Bezugskurve werden die gemessenen Gerinnungszeiten in Prozent der Norm umgerechnet oder als Prothrombin Ratio oder als INR (International normalisierte Ratio) angegeben.

18 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 218 Quick-Test Resultat in Sekunden =TPZ Abhängig von Art des Thromboplastins (aus Hirn, Lunge, Plazenta, von Kaninchen, Rind, Mensch, rekombinant) Methode (mechanisch, optisch) Sehr unterschiedliche Messergebnisse mit verschiedenen Reagenzien Normbereich nur reagenzienabhängig möglich, keine Vergleichbarkeit unterschiedlicher Thromboplastine

19 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 219 Quick-Test Umrechnung in Prozent Kalibrierung mit Normal- oder Kalibrierplasma Umrechnung der Sekundenwerte anhand einer Bezugskurve Bessere Vergleichbarkeit der Ergebnisse Normbereich: 70 – 120 % (allgemein gültig)

20 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 220 Quick-Test Prothrombin-Ratio (PR) und INR PR = Um eine internationale Vergleichbarkeit der Werte in der stabilen Phase einer oralen Antikoagulatientherapie zu gewährleisten, wurde 1983 von der WHO die INR (international normalisierte Ratio) eingeführt. INR = PR ISI ISI = Internationaler Sensitivitätsindex = Steigung der PR gemessen am WHO-Standard (reagenzabhängig) Thromboplastinzeit Probe Thromboplastinzeit Normalplasma

21 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 221 Quick-Test Gründe für die Anwendung der INR Standardisierung der Intensität der Antikoagulation für eine bestimmte Indikation unabhängig von Thromboplastin und Gerät (INR 2,0 – 5,0) Bessere Vergleichbarkeit verschiedener Labors Bessere Überwachung und Therapieführung des Patienten Die INR ist nur in der stabilen Phase der oralen Antikoagulation anwendbar!

22 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 222 Quick-Test Halbwertszeit Faktor in Stunden während der stabilen Phase VII % Protein C 2 - 7ca. 50 % IXca % Xca % Protein S ca % IIca %

23 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 223 Quick-Test Verminderung des Quick Leberparenchymerkrankungen Cumarintherapie, Vitamin-K-Mangel Faktorenmangel der erfassten Faktoren Hohe Heparindosierung Bei Neugeborenen normal (bis 30 %) Fibrinogenspaltprodukte Inhibitoren gegen erfasste Faktoren

24 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 224 Quick-Test Quick 50 – 70 % Weitgehend normale Gerinnung Bei Lebererkrankungen Hinweis auf eingeschränkte Syntheseleistung Quick 30 – 50 % Hämorrhagische Diathese ohne Neigung zu Spontanblutungen Kleine operative Eingriffe durchführbar Quick 15 – 30 % Therapeutischer Bereich bei oraler Antikoagulation Quick unter 10 % Ausgeprägte hämorrhagische Diathese mit Neigung zu Spontanblutung (unter 4 % lebensgefährlich)

25 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 225 aPTT = aktivierte partielle Thromboplastinzeit Globaltest für das intrinsische System. Erfasst werden: Faktoren XII, XI, IX, VIII (endogen), PK, HMWK Inhibitoren (z.B. Heparin) XIXIaIXIXa + VIIIa + PL + Ca ++ VIII Fremdoberfläche XIIXIIa PK, HMWK Thrombozyten-PL X Xa + Va + PL + Ca ++ V IFibrin s IIIIa

26 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 226 aPTT Prinzip: Durch die Inkubation von Plasma mit Phospholipiden (partielle Thromboplastine = PF 3) und negativ geladenen Oberflächen (Aktivatoren) werden die Faktoren des intrinsischen Systems aktiviert. Durch Zugabe von Ca ++ wird der Gerinnungsvorgang gestartet und die Zeit bis zur Gerinnselbildung gemessen.

27 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 227 aPTT Aktivatoren Partikelförmige Aktivatoren: Kaolin, Celit, Silikate Lösliche Aktivatoren: Ellagsäure Bei Vollautomaten zunehmend verwendet! Die Art des Aktivators beeinflusst die Sensitivität (Präkallikrein wird in Gegenwart von Kaolin besonders gut erfasst, aber kaum in Gegenwart von Ellagsäure) Referenzbereich Mittlerer Bereich: 26 – 40 s (abhängig von Aktivator und Phospholipid)

28 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 228 aPTT Verlängerung der PTT Mangel an Faktor VIII (Hämophilie A), Faktor IX (Hämophilie B), Faktor XI oder XII Von Willebrand-Faktor-Mangel (vWF dient dem Faktor VIII als Schutzprotein vor Proteolyse) Lupusantikoagulans (= Antiphospholipid-Antikörper) Fibinogenspaltprodukte Heparin Faktor < 1 % aPTT 1aPTT 2aPTT 3 VIII IX XI XII Faktor-XII-Mangel: ausgeprägte Verlängerung, aber keine Blutungsneigung!

29 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 229 aPTT Verkürzung der aPTT Manchmal bei akuten Thrombosen Fehler bei der Blutentnahme Gerinnungsaktivierung durch zu langsame Entnahme Ungenügendes Mischen => Gerinnungsaktivierung und kleine Gerinnsel Deutliche Gerinnung durch sichtbare Gerinnsel

30 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 230 aPTT - Heparin Unfraktioniertes Heparin (HMWH) Antithrombin III verbindet sich mit Heparin zu einem Komplex, der Thrombin und Faktor Xa mit hoher Geschwindigkeit hemmt. Heparin löst sich aus dem entstandenen Komplex und steht für neue Aufgaben zur Verfügung. HMWHAntithrombin III IIa Xa

31 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 231 aPTT - Heparin Fraktioniertes Heparin LMWH Fraktioniertes Heparin (= niedermolekulares Heparin) wird aus unfraktioniertem Heparin isoliert. Es hat nur noch geringe Anti-Thrombin-Aktivität, da die Bindungsstelle für Thrombin fehlt. Antithrombin III IIa Xa LMWH Ähnliche Wirkung haben auch Heparinoide, z.B. Danaparoid- Natrium = Orgaran®

32 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 232 aPTT - Heparin Unfraktioniertes Heparin (Liquemin ® ) verlängert die aPTT v.a. durch Hemmung von Thrombin (keine Feedback-Aktivierung von Faktor VIII) => aPTT zur Kontrolle der Heparintherapie mit HMWH geeignet Fraktioniertes Heparin (Fragmin ®, Clexane ®, Fraxiparin ® ) verlängert die aPTT kaum, da nur minimale Hemmung von Thrombin stattfindet (Feedback-Aktivierung von Faktor VIII). => aPTT zur Kontrolle der Heparintherapie mit LMWH nicht geeignet

33 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 233 aPTT - Heparin Bei s.c. Heparingabe (HMWH) erreicht die aPTT schnell den Höchstwert und fällt nach 1 Stunde langsam wieder ab (Halbwertszeit 60 min.) LMWH hat eine längere Halbwertszeit (100 – 180 min.), Orgaran ® sogar 24 Stunden Plättchenfaktor 4 (aus zerfallenden Thrombozyten) und histidinreiches Glykoprotein binden an Heparin Die Heparinelimination erfolgt z.T. über die Niere und durch Bindung an Endothel => aPTT ist abhängig vom Zeitpunkt der Heparingabe, der Blutentnahme, der Lagerung und dem Zustand des Patienten

34 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 234 Thrombinzeit Standardtest für die Überwachung der Heparintherapie mit unfraktioniertem Heparin Höhere Sensitivität als aPTT Geringere Präzision bei höheren Heparinkonzentrationen Überwachung fibrinolytischer Therapien und Hyperfibrinolyse Suchtest zur Erfassung von Fibrinbildungsstörungen (z.B. Dysfibrinogenämie)

35 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 235 Thrombinzeit Prinzip: Durch Zugabe einer definierten Menge Thrombin bildet sich aus Fibrinogen Fibrin. Die Zeit bis zur Gerinnung wird gemessen. IFibrin sIIa

36 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 236 Thrombinzeit Die Thrombinzeit ist abhängig von: Hemmung des zugegebenen Thrombin durch Heparin (HMWH) Hirudin u.ä. (direkte Thrombinhemmung) Fibrinogenspaltprodukte (hemmen die Fibrinpolymerisation) Fibrinogenkonzentration (erst bei sehr geringer Konzentration) Dysfibrinogenämie

37 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 237 Thrombinzeit Normalbereich: 16 – 20 s (bei Thrombinkonz. 1,5 IE/ml) ( s bei Thrombinkonz. von 3 IE/ml) Verlängerung auf 24 – 30 s: Ausreichende Hemmwirkung bei prophylaktischer Heparingabe Schwere Gerinnungsstörung bei DIC oder Hyperfibrinolyse Verlängerung auf 40 – 60 s: Relativ sicherer Schutzbereich vor venösen Thromboembolien (Heparintherapie) Bedrohliches Zeichen bei DIC oder Hyperfibrinolyse Dysfibrinogenämie Nicht mehr messbar: Heparinkonzentration über 1 IE/ml Extreme Hyperfibrinolyse

38 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 238 Fibrinogen Bestimmung des gerinnbaren Fibrinogens nach Clauss Prinzip: Durch Zugabe von Thrombin im Überschuss bildet sich aus Fibrinogen Fibrin. Die Zeit bis zur Gerinnung wird gemessen. Derived Fibrinogen (abgeleitetes Fibrinogen) Während einer optischen Quick-Bestimmung kann die Fibrinmenge anhand der Steigung der Extinktion bestimmt werden. Immunologische Fibrinogenbestimmung Konzentrationsbestimmung mit Hilfe von spezifischen Antikörpern

39 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 239 Fibrinogen Normalbereich gerinnbares Fibrinogen: 1,5 – 4,0 g/l (150 – 400 mg/dl) Fibrinogen > 4,0 g/l (> 400 mg/dl): Als Akutphaseprotein erhöht bei Entzündungen, postoperativ, u.ä. Häufig im Alter (dauerhaft erhöhtes Fibrinogen gilt als Risikofaktor für koronare Herzkrankheiten) bei Diabetes mellitus bei Nikotinabusus

40 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 240 Fibrinogen Fibrinogen < 1,5 g/l (< 150 mg/dl): Durch den Verbrauch von Gerinnungsfaktoren und Fibrinogen bei DIC Die bei einer Fibrinolyse(therapie) entstehenden Fibrinogenspaltprodukte hemmen die Polymerisation => falsch niedrige Werte Dysfibrinogenämie Ausgeprägte Störung der Leberfunktion

41 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 241 Einzelfaktoren Wann ist die Bestimmung erforderlich? Unerklärbare Verlängerungen der Gerinnungszeit im Globaltest Verlaufskontrolle bei bekanntem Faktorenmangel Abklärung einer Hyperkoagulabilität

42 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 242 Einzelfaktoren Prinzip: Verdünntes Patientenplasma wird mit Mangelplasma im Überschuss versetzt. (Mangelplasma enthält alle Gerinnungsfaktoren außer dem Faktor, der bestimmt werden soll.) Dadurch ist die Gerinnungszeit der Probe nur noch abhängig vom zu bestimmenden Faktor im Patientenplasma. (Der Faktor mit der geringsten Konzentration limitiert den Test!) Mit einem modifizierten Globaltest (Quick bei Faktor X, VII, V, II; aPTT bei Faktor XII, XI, IX, VIII) wird die Gerinnungszeit bestimmt und anhand einer Bezugskurve in Prozent Gerinnungsaktivität umgerechnet.

43 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 243 Einzelfaktoren Normalbereiche: Faktor II70 – 120 % Faktor V60 – 120 % Faktor VII70 – 120 % Faktor X60 – 120 % Faktor VIII50 – 150 % (Akutphaseprotein!) Faktor IX70 – 120 % Faktor XI70 – 120 % Faktor XII70 – 120 %

44 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 244 Antithrombin III Antithrombin ist der wichtigste Inhibitor, da es Thrombin, Faktor Xa und die meisten anderen Gerinnungsenzyme inaktiviert. AT III ist ein langsamer Inhibitor, die Reaktionsgeschwindigkeit wird jedoch durch Heparin stark gesteigert. Bei sehr geringen AT III-Konzentrationen (< 30 %) ist die Heparinwirkung eingeschränkt. Bereits subnormale AT III-Konzentrationen begünstigen eine Thromboseneigung.

45 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 245 Antithrombin III Prinzip: Chromogene Bestimmung der Thrombin- bzw. Faktor Xa- Aktivität Durch Zugabe von Heparin im Überschuss sowie Thrombin oder Faktor Xa zum Plasma wird AT III vollständig im Komplex gebunden. Das restliche Enzym (Thrombin oder Faktor Xa) spaltet von einem chromogenen Substrat einen Farbstoff ab. Die gemessene Extinktion ist umgekehrt proportional zur AT III-Konzentration. Heparin AT III Xa Ext.Photometer Heparin

46 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 246 Antithrombin III Normalbereich: 80 – 120 % AT III 40 – 70 % Angeborener Mangel mit erhöhtem Risiko für venöse Thromboembolien Eingeschränkte Leberfunktion Verbrauch von Gerinnungsfaktoren und Inhibitoren bei DIC AT III < 40 % Fortgeschrittene Leberzirrhose DIC

47 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 247 D-Dimere D-Dimere entstehen beim Abbau von Fibrin durch Plasmin Gleichzeitig wird Fibrinogen durch Plasmin gespalten. Die entstehenden Spaltprodukte hemmen die Fibrinpolymerisation D-Dimer D – Fragmente – Y

48 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 248 D-Dimere Wann sollte eine D-Dimer-Bestimmung durchgeführt werden? Verdacht auf tiefe venöse Thrombose D-Dimere im Normalbereich schließen mit %iger Wahrscheinlichkeit einen Gefäßverschluss aus! Voraussetzung: normale fibrinolytische Aktivität! Krankheitsbilder mit gesteigerter Gerinnungsaktivität (DIC) Krankheitsbilder mit gesteigerter Fibrinolyse

49 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 249 D-Dimere Prinzip: die D-Dimer-Bestimmung ist eine immunologische Bestimmung. Mit Hilfe monoklonaler Antikörper auf Latexpartikeln werden D-Dimere in einer Antigen-Antikörper-Reaktion gebunden. (Latexagglutination) Dadurch kommt es zu einer Änderung der Lichtdurchlässigkeit bzw. Lichtstreuung, die gemessen wird. Auch ELISA-Tests sind möglich, dabei kommt es zu einer Farbzunahme.

50 Inge Vonnieda Grundlagen der Blutgerinnung Teil 250 D-Dimere Normalbereich: < 0,5 µg/ml (500 µg/l) Erhöhte Konzentration: Thromboembolische Erkrankungen Intra- und postoperativ Hämolytisch-urämisches Syndrom Sepsis DIC (Verbrauchskoagulopathie) Transplantatabstoßung Tumoren, Leukämien Stress (nur leichte Erhöhung)

51 Grundlagen der Blutgerinnung Teil 3 Diagnostik und Therapie 21. Januar 2005


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