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Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn1 Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn Molekulare Biotechnologie Ruprecht-Karls-Universität.

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Präsentation zum Thema: "Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn1 Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn Molekulare Biotechnologie Ruprecht-Karls-Universität."—  Präsentation transkript:

1 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn1 Jan-Philipp Stier Marc Matuszewska Wendelin Wolf Lars Lüdicke Thomas Horn Molekulare Biotechnologie Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

2 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn2 Gliederung I.Begriff und Geschichte der PCR II.Ablauf der PCR allgemein III.Mathematische Beschreibung der PCR IV.mathematische Problemstellungen der PCR V.Quantitative PCR VI.RT-PCR VII.Real Time PCR VIII.Beispiele

3 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn3 I. Begriff und Geschichte PCR (Polymerase Chain Reaction) Polymerase-Kettenreaktion zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren Erfinder: Kary Mullis (1985) PCR eröffnet in fast allen Bereichen der Naturwissenschaft zahlreiche neue Möglichkeiten Nobelpreis für Mullis 1993

4 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn4 II. Ablauf der PCR allgemein I Benötigte Reagenzien (Master Mix) Nukleotide (dNTP): dATP, dGTP, dTTP, dCTP Taq DNA-Polymerase: Enzym repliziert DNA Enzym-Cofaktor: Mg 2+ Enzym, welches Kontaminationen abbaut Puffer: Erhaltung pH-Wert, Salzkonzentration spezifische Primer (20-30 Basen: sense-, antisense) zu amplifizierende DNA

5 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn5 II. Ablauf der PCR allgemein II PCR ist 3-Schritt-Prozess (Zyklus) 1. Denaturierung (T>90°C): ein dsDNA Molekül in zwei ssDNA Moleküle 2. Annealing (Anlagerung: 40°C

6 6 zu vermehrender DNA-Abschnitt Denaturierung (T>90°C) Annealing (40 – 65 °C) DNA-Synthese (72 °C)

7 7 Schutzhaube Heizblöcke Steuerungseinheit PCR-Gerät

8 8 III. Mathematische Beschreibung der PCR I Zyklus 1Zyklus 2Zyklus 3Zyklus 4 1 Denaturierung 2 Annealing 3 Extension N = N 0 * 2 n N = Zahl der amplifizierten Moleküle N 0 = Zahl der Startmoleküle n = Zahl der Zyklen n N N 0 N N 0

9 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn9 III. Mathematische Beschreibung der PCR II Plateau-Phase Limitierung von Reaktionskomponenten Thermische Inaktivierung der DNA Polymerase Reassoziation der PCR-Produkte konkurriert mit Primeranlagerung theoretisch: 20 Zyklen: 1,048, Zyklen: 1,073,741,824 n N N 0 N N 0

10 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn10 III. Mathematische Beschreibung der PCR III Effizienz E der PCR: Anteil der Matrizen (Templates), die in jedem Schritt umgesetzt wird 100% E meist um die 85% geringe Veränderungen E große Veränderungen N Beispiel: E=0.85; n=30 => N=10.4*10 7 N 0 E=0.80; n=30 => N= 4.6*10 7 N 0 E = Amplifikationseffizienz N = N 0 * (1+E) n

11 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn11 IV. Mathematische Problemstellungen I Primer Schmelztemperatur Einfaches Modell Primer kürzer als 14 Nukleotide: T M =2*(A+T)+4*(G+C) Primer länger als 14 Nukleotide: T M =64.9+(G+C-16.4)/(A+T+C+G) entscheidend ist der GC Gehalt (3 H- Bindungen), beeinflusst T M maßgeblich

12 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn12 IV. Mathematische Problemstellungen II Kompliziertes Modell R… molare Gaskonstante R=1.987(cal/°C*mol) … dimensionslose molare Primerkonzentration T 0 = °C t… Temperaturkurrektor t=-21,6°C S… Entropie des Primers in cal/(K*mol) H… Enthalpie des Primers in kcal/mol

13 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn13 IV. Mathematische Problemstellungen III Berechnung Enthalpie, Entropie: H(p)= i=1 n-1 H(p i,p i+1 ); S äquivalent Beispiel: p=GGAT H(GGAT)= H(GG) + H(GA)+ H(AT) (p i ;p i+1 ) H(p i ;p i+1 ) S(p i ;p i+1 ) AA oder TT AT TA CA oder TG GT oder AC CT oder AG GA oder TC CG GC GG o. CC

14 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn14 V. Quantitative PCR I Frage: Wie groß ist N 0 ? Methode 1: Titrationsanalyse Verwendung externen Standards mit bekanntem N 0 Anfertigung Verdünnungsreihe von Standard und Probe Amplifikation in n Zyklen Berechnung N 0 Probe über Steigung

15 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn15 Auswertung: der Unterschied von N 0 ist proportional zu den Steigungen der Geraden man sucht Wert auf x-Achse (linearer Teil) Abtragung der dazu gehörigen y-Werte Differenz dieser Werte gleich der Differenz von N 0 von Probe und Standard so etwa 2- bis 10-fache Konzentrationsunterschiede bestimmbar V. Quantitative PCR II Probe Standard Log N Log N 0

16 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn16 einfaches Beispiel: N 0S =100 (log N 0S =2), n=20, E=0.85 => N S =100*(1+0.85) 20 N S =2.21*10 7 => log N S =7.344 N P bei N 0 =100 => log N P =7.568 log N 0S ergibt log N 0P log N 0P =2.224 N 0P =168 V. Quantitative PCR III Probe Standard Log N Log N

17 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn17 Methode 2: lineare Analyse N = N 0 * (1+E) n (nach: Y = a * X + b) Log N = [Log (1+E)] * n + Log N 0 n 0 Log N 0 Log (1+E) V. Quantitative PCR III

18 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn18 VI. Reverse Transcriptase oder RT-PCR Ausgangsmaterial: m-RNAds-cDNA Enzym: Reverse TranscriptaseRetroviren Tth-Polymerase Reverse Transcriptase Mangan-Ionen

19 19 35mRNA 35 Primer 1 Primer einzelsträngige cDNA doppelsträngige 35 5 cDNA 3 Reverse Transkription Amplifikation Primer 2 53 Primer 1 35 Synthese des komplementären cDNA Stranges

20 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn20 VII. Real Time PCR Im Prinzip wie eine Standard PCR, jedoch mit Farbstoff der in die DNA interkaliert In diesem Zustand Detektion möglich früher: Ethidiumbromid und Detektion mit Videokamera heute: Fluoreszierende Farbstoffe und digitale Aufnahme Echtzeitmessung mit jedem Zyklus

21 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn21 Zyklenzahl Fluoreszenz

22 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn22 VIII. Messung von Metallothionein-I mRNA Auswertung Auftragen der Werte in ein Diagramm: x-Achse = log(Std.DNA) y-Achse = log(Verhältnis) Geradengleichung: Schnittpunkt mit der x-Achse ist Äquivalenzpunkt (log1=0)

23 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn23 VIII. Gen-Expression durch RT-PCR C T -Wert -Patientenabhängig -Errechnet sich aus den Zyklen, die benötigt werden, um einen spezifischen Schwellenwert zu überschreiten ( Fluoreszenz) 1.Normierung des C T -Wertes des Target-Gens 2.Eichung des C T(Target) -Wertes zu Bezugsexpressionsgröße 2 -C T relative Expression in Bezug auf Calibrator-Gen (100%)

24 Stier/Matuszewska/Wolf/Lüdicke/Horn24 Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit


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