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Genexpressionsanalyse Diplomarbeit 1. Referat Mohammad Esad-Djou.

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Präsentation zum Thema: "Genexpressionsanalyse Diplomarbeit 1. Referat Mohammad Esad-Djou."—  Präsentation transkript:

1 Genexpressionsanalyse Diplomarbeit 1. Referat Mohammad Esad-Djou

2 Genexpressionsanalyse2 Ziele Beschreibung der Probleme Überblicke: Biologischer Hintergrund Pre-Processing Stand der Forschung Zielsetzung der Diplomrbeit

3 Genexpressionsanalyse3 Gliederung Problemstellung Biologischer Hintergrund Biologische Datenbanken Pre-Processing Backgrund-Korrektion Normalisierung PM Korrektion Summarization/ Aggregation Stand der Forschung: GeWare Ziel der Diplomarbeit Zusammenfassung Literatur

4 Genexpressionsanalyse4 Einführung Genexpressionsanalyse Grosse Bedeutung in vielen Bereichen biomedizinischer Forschung Ausbildung der einem Gen inhärenten Eigenschaften GeneChip-Technologie: Hybridisierung von Nukleinsäurefragmenten an immobilisierten Probes Probe: 25mere Oligonukleotide

5 Genexpressionsanalyse5 Problemstellung: Messung und Analyse

6 Genexpressionsanalyse6 Problemstellung Messung der Genexpression: Suche nach Genen mit gleicher Expression bzw. differenzieller Expression Techniken: Northern Blotting, SAGE, Microarray,… Vorhandene Verfahren zur Messung und Analyse sind nicht zufridend! Optimierung vorhandener Verfahren, um präzise und effektive Genexpressionsanalyse möglich zu sein.

7 Genexpressionsanalyse7 Überblicke: Biologische Hintergrund Grundbegriffe: Gen, Protein, Nukleotide, Codon, DANN, RNA, Basenpaar… Entstehung der Proteine Replikation: Verdoppelung der DNA Transkription: umschreiben der DANN in RNA während der Genexpression Translation: Übersetzung der mRNA in Proteine. Synthese eines Proteins an einer mRNA während der Genexpression

8 Genexpressionsanalyse8 Überblicke: Materielle Verarbeitung Weg des Experimentes von der Probenentnahme bis zum Scannen eines Chips Kombination der Photolithographie und kombinatorischen Chemie

9 Genexpressionsanalyse9 Überblicke: Materielle Verarbeitung Entstehung der Proben, die an einem Silizium-Wafer festgelegt ist Proben: 25mere Oligonukleotide

10 Genexpressionsanalyse10 Überblicke: Materielle Verarbeitung Fragmentierung der cRNA mit Hilfe von Metallsalzen und Hitze Hybridisierung: Doppelstrangbildung von komplementären einzelsträngigen DNA- und/oder auch RNA- Molekülen. Waschen, Färben, Scannen: letzte Schritte vor Imageanalyse GeneChip Probe Array

11 Genexpressionsanalyse11 Überblicke: Materielle Verarbeitung

12 Genexpressionsanalyse12 Überblicke: Datenanalyse Ü bergang von materielle Ebene zur Pre- Processing Image Analyse: gespeicherte Informationen wird durch Computer analysiert und eine optimierte Image erstellt Grund: Probleme bei Vorbereitung in materielle Ebene, z.B. R ä umliche Effekte, wie die geschmierten Fl ä che durch Staub auf den Dia usw.

13 Genexpressionsanalyse13 Überblicke: Biologische Datenbanken

14 Genexpressionsanalyse14 Überblicke: Biologische Datenbanken

15 Genexpressionsanalyse15 Average Difference: PM – MM Betrachte alle Differenzen ohne Minimum und Maximum. Berechne das getrimmte Mittel y und Standardabweichung s y aus verbleibenden Differenzen. Eliminiere nun aus allen Differenzen die, die au ß erhalb von liegen. Pre-Processing: Backgrundkorrektion - MAS 4.0

16 Genexpressionsanalyse16 Pre-Processing: Backgrundkorrektion - MAS 5.0 Micro Array Suite: Standard Pre-Processings- verfahren in Affymetrix MAS 5.0: Verwendet beide PM und MM Proben Pre-Processing der Probe-Zelle-Intensit ä ten: Background Subtraction und Noise Correction. Justierung Tukey s Biweight Estimator-Algorithmus Chip: k-dimentionale Array (Default = 16) Berechnung des Hintergrundes b k und Noise-Value n k Erhalten des probespezifischen Hintergrundes B(x,y) bzw. einer Noise-Value n(x,y) durch Berechnen einer bewerteten Summe alles b k und n k B(x,y) ist subtrahiert von der roh Intensit ä t: Falls < n(x,y), dann ersetzte die Probe-Intensit ä t durch n(x,y)

17 Genexpressionsanalyse17 MAS 5.0: Ideal Mismatch Problem: Falls physische Sch ä tzung f ü r BG m ö glich, sonst unm ö glich Absch ä tzung IM: auf Basis unserer Kenntnis vom ganzen Probe-Mengen oder auf dem Benehmen von Untersuchungen im Allgemeinen Diese Sch ä tzung kann auch auf dem durchschnittlichen Verh ä ltnis zwischen PM und MM, oder (wenn dieses Ma ß selbst zu klein ist) ein Wert, leicht kleiner als PM basiert werden. Bestimmung des Hintergrundbruchvertreters: One-Step Biweight Algorithmus (T b i) Biweight Specific Background (SB) f ü r Probe-Paar j in Probe- Menge i:

18 Genexpressionsanalyse18 MAS 5.0: Ideal Mismatch Drei F ä lle:

19 Genexpressionsanalyse19 MAS 5.0: Ideal Mismatch Probe-Wert und Signal Log Value Berechnung der idealen Abweichungswert: Probe-Wert: Sch ä tzung der absoluten Expressionswert f ü r Probe-Menge: Skalierte Probe-Wert: Wenn die Algorithmeneinrichten alle oder gew ä hlte skalierte Probe-Mengen auf ein Ziel indizieren, wird ein gewicht Faktor (sf ) berechnet:

20 Genexpressionsanalyse20 MAS 5.0: Ideal Mismatch Der berichtete Wert der Probe-Menge i ist: Normalisierungsfaktor (nf): mit Scaled Probe Value:

21 Genexpressionsanalyse21 MAS 5.0: One-Step Tukey s Biweight Algorithm eine Methode, um ein robustes Mittel unbeeinflusst von Outlier zu bestimmen. Bestimmung des Zentrum die Median der Daten Bestimmung des Abstandes von jedem Datenpunkt von der Median, um zu bestimmen, wie viel jeder Wert zum Mittel beitragen sollte Berechnung der Gewichte : korrigierten Werte k ö nnen jetzt durch Verwenden der One-Step w- sch ä tzen berechnet werden:

22 Genexpressionsanalyse22 MAS 5.0: Nachteil - Verrechnung Hauptnachteil: Man kann gleichzeitig nur zwei Proben vergleichen! Dies kommt schnell aus Hand heraus (ausarten, ausufern), wenn man komplexe Versuche durchf ü hrt. Die Analyse basiert auf PM-MM Modell MAS 5.0 (Siehe Folie 17): log (PMij – CTij) = log (qi) + eij, j = 1, …, J CT: replaces MM when MM>PM (avoid log of neg. numb.) qi: expression quantity on array eij: error i: arrays j: probe pairs Problem: error does not have equal variance for j = 1, …, J >> larger mean intensities have larger variances! Signal wird mit Gewalt positiv gestellt. Der Ideal Match ist Mismatch plus. Dadurch viele sehr kleine Signale.

23 Genexpressionsanalyse23 MAS 5.0: Consequences for Datanalyse

24 Genexpressionsanalyse24 MAS 5.0: Consequences for Datanalyse

25 Genexpressionsanalyse25 Fragen?


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