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TrFTIR Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion.

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Präsentation zum Thema: "TrFTIR Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion."—  Präsentation transkript:

1 trFTIR Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion

2 NMR und XRD: Struktur eines Proteins im Grundzustand, statisch ? trFTIR gibt Informationen über die Proteindynamik auf atomarer Ebene in μs bis ns Zeitauflösung unter physio- logischen Bedingungen! Informationen: - Ladungsverteilung - H-Brücken - Protonierungszustände - Kinetik Nutzung von trFTIR in der Bioanalytik

3 Identifizierung und Beobachtung von reaktiven Gruppen Differenzspektren

4 Hohe Anforderungen, da Hintergrundintensität viel stärker ist, als die Intensitätsänderungen (3-5 Größenordnungen) Michelson Interferometer (Multiplexvorteil) Gleiche Bedingungen bei jeder Messung! Wiederholungsmessungen zur Verbessung des Signal/Rausch Verhältnisses (~ ) Apparatur

5 L M Z D Michelson Interferometer Apparatur

6 Reaktionsinitiierung Zeitauflösung a) Direkt über ns - Laserblitz nur bei photobiologisch aktiven Proteinen z.B. Bacteriorhodopsin b) Photolabile Trigger-Substanzen z.B. Caged ATP c) Mischzellen max. µs - Auflösung

7 Rapid Scan Spektrenaufnahme mit schneller Spiegelbewegung schnelle aufeinanderfolgende Aufnahme vollständiger Interferogramme - I t (x) ms - Auflösung auf alle Reaktionen anwendbar Step Scan Bei fixierter Spiegelposition wird Zeitabhängigkeit des Signals gemessen - I x (t). Wiederholung der Messung bei jeder Spiegelposition ns - Auflösung (Detektionsbegrenzung) nur zyklische Reaktionen (z.B. Bacteriorhodopsin), andernfalls besondere Technik notwendig Zeitauflösung

8 Häufige Reaktionswiederholung (oft > 1000x) genau gleiche Bedingungen! Techniken für azyklische Reaktionen: Flow cells Austausch der Substanz - hoher Substanzbedarf - kleine Extinktionsänderungen nicht messbar (grosse Zelldimensionen) Fokussierung des Laser/IR Strahls Messung von einzelnen Probensegmenten - 4 μm Film zwischen CaF 2 -Fenstern (Filmdicke ± 10%) - Aufheizung der Probe - Beeinflussung von Segmenten durch Streulicht Zeitauflösung Step Scan Technik

9 Austausch von Aminosäuren Eine bestimmte Extinktions- änderung entfällt (neue Aminosäure ist unreaktiv) Problem: invasive Mutation Isotopenmarkierung Verschiebung der Wellenzahl der Extinktionsänderung (Isotopeneffekt) Bandenzuordnung

10 Kommerzielles FTIR Spektrometer mit Globar, Beamsplitter, Spiegel Farbstofflaser (Laserblitz ca. 20 ns) Individuelle Anfertigung von Messzelle und Signalverstärker Kommerzieller stickstoffgekühlter MCT-Detektor (Mercury/Cadmium/Tellur) mit einer Zeitauflösung von ca. 20 ns Schnelle Photodiode, die durch Laserreflex aktiviert wird und Aufnahme der Daten auslöst 3 mbar Vakuum im Geräteraum, um Vibration des Spiegels durch Geräusche zu minimieren Isolationstisch und Temperaturkontrolle Beispiel für ein Step Scan trFTIR Gerät

11 Vorteile der trFTIR - physiologische Bedingungen - Informationen über H-Atome und Ladungsverteilungen - Instabile Intermediate sind messbar - Kinetische Informationen Nachteil Noch keine Standardprozedur zur Vermessung verschiedener Proben verfügbar. Aufwändige, auf das Problem zugeschnittene, technische Modifikationen Zusammenfassung und Ausblick Ausblick - Standardisierung und Validation der Methoden - fs - Zeitauflösung - Theoretische Berechnung kompletter IR-Spektren und Vergleich mit dem Experiment Struktur und Ladungsverteilung im Reaktionsverlauf!

12 Anwendung Fehlfunktion von Proteinen Auslöser vieler Krankheiten Untersuchung molekularer Reaktionsmechanismen Verständnis Struktur, Funktion und Interaktion von Proteinen Voraussetzung Entwicklung gezielter wirkender pharmakologische Substanzen mit weniger Nebenwirkungen

13 Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin Aufklärung katalytische Schritte Mechanismus stimmt mit 10 Jahre später über Röntgenstrukturanalyse ermittelter Kristallstruktur überein Bakteriorhodopsin [2]

14 Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin Protonentransfer im Bakteriorhodopsin mit Hilfe von Wasser [1] Retinal über Schiffsche Base Gebunden Wird durch Licht angeregt Isomerisierung (pk-Änderung) H-Brücke W402 aufgespalten Freie OH-Gruppe W401 kann negative Ladung des Asp 85 nicht mehr stabilisieren Protonentransfer von Schiffscher Base auf Asp 85 Arg 82 bewegt sich Protonierter Wasserkomplex nahe der Oberfläche destabilisiert Gibt Proton ab Wasser aktiv beteiligt

15 Wie Proteine Protonen pumpen 1190 cm -1 Deprotonierung Zentrale Protonenbindestelle 1762 cm -1 Protonierung Asp-85 Differenzspektrum Protonentransfer Bakteriorhodopsin [1]

16 Schaltmechanismus von GTPasen RAS kontrolliert Wachstumssignal Mutationen unkontrolliertes Zellwachstum GAP hydrolysiert nicht mehr Verfolgt RAS-GTP-Hydrolyse Struktur vom Intermediat (H 2 PO 4 2- ) [1]

17 Schaltmechanismus von GTPasen GTP-Hydrolyse [1] Differenzspektrum GTP-Hydrolyse [2] Ras(*Ras)Gap: Intermediat (1143 cm -1 ) Katalyse durch positive geladene Lys, Arg und Mg 2+ Mutation Arg zu ungeladenem Gln -> Verlangsamung

18 Pharmascreening Nahezu alle Moleküle IR-aktiv (keine Fluoreszenzmarkierung) Kann direkt Einfluss Pharmaka auf Protein bestimmen z.B. Reaktivierung RAS Studieren potentieller Pharmaka Identifizierung aktivierender Pharmaka Substanzen in natürlicher Umgebung studieren (RAS über Lipidanker an Membranmodelle binden die auf ATR-Oberfläche aufgetragen sind)

19 –Entwicklung verbesserter Biokatalysatoren –Herstellung gezielter wirkender Pharmaka mit weniger Nebenwirkungen –Untersuchung Protein mit unbekannter Raumstruktur –Charakterisierung G-Proteingekoppelter Rezeptoren Ausblick

20 Literatur 1. Proteinreaktionen: aufgelöst mit trFTIR, Nachrichten aus der Chemie, 5 2.http://www.innovationspreis- ruhr.de/Entwicklungsbeschreibung_17%2002%2006.pdf 3.K. Gerwert, Ber. Bunsen-Ges. Phys. Chem., 1988, 92, W. Uhrmann, A. Becker, C. Taran, F. Siebert, Appl. Spectrosc., 1991, 45, R. Rammelsberg, B. Hessling, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Appl. Spectrosc., 1997, 51, R. Rammelsberg, S. Boulas, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Vib. Spectrosc., 1999, 19, 143


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