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Analyse epigenetischer Veränderungen auf Chromosom 13q (C13orf19 und DLEU7) beim Prostatakarzinom Michael Hering, Uta Schmidt, Katja Robel, Heike Petzold.

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Präsentation zum Thema: "Analyse epigenetischer Veränderungen auf Chromosom 13q (C13orf19 und DLEU7) beim Prostatakarzinom Michael Hering, Uta Schmidt, Katja Robel, Heike Petzold."—  Präsentation transkript:

1 Analyse epigenetischer Veränderungen auf Chromosom 13q (C13orf19 und DLEU7) beim Prostatakarzinom Michael Hering, Uta Schmidt, Katja Robel, Heike Petzold 1, Susanne Füssel, Axel Meye und Manfred P. Wirth Klinik und Poliklinik für Urologie, 1 Klinik für Kinderheilkunde, Technische Universität Dresden Einleitung Der Funktionsverlust von Tumor- oder Metastasensuppressorgenen geht häufig mit allelischen Imbalancen bzw. Allelverlusten (LOH) einher. Der lange Arm des Chromosoms 13 (Abb.1) zählt zu den am häufigsten veränderten DNA-Abschnitten beim Prostatakarzinom. Neben diesen Veränderungen können auch epigenetische Veränderungen zur Verminderung der Genexpression und damit einem funktionellen Genverlust führen. Unter epigenetischen Veränderungen versteht man Mechanismen, die ohne Veränderung der DNA–Sequenz zur Stillegung oder Aktivierung von Genen führen können. Hierzu zählen DNA–Hyper- und globale DNA–Hypomethylierung. DNA–Hypermethylierung führt in der weiteren Folge zu Histonmodifikationen (Deacetylierung), was eine engere Packung des Chromatins und die Behinderung der Bildung des Transkriptionsinitiationskomplexes bedingt. Methyliert wird DNA am 5´ Kohlenstoff des Cytosins innerhalb sog. CpG-Islands, DNA-Abschnitten, die sich durch ein überdurchschnittlich häufiges Auftreten von CG-Dinukleotiden auszeichnen. Meist liegen CpG-Islands innerhalb des Promoterbereiches eines Genes, sie können aber auch über beliebig viele Exon- und Intronsequenzen spannen. Für eine Anzahl von Genen in verschiedenen Tumoren ist dieser Regulationsmechanismus bereits nachgewiesen worden (Abb.2). Beim Prostatakarzinom ist besonders häufig ein Abschnitt zwischen den bekannten Tumorsuppressorgenen BRCA2 und RB1 (13q q14) von LOH betroffen, auch weiter telomer (C13q21) konnten Allelverluste nachgewiesen werden. Ein Kandidatengen konnte mit C13orf19 im hiesigen Forschungslabor identifiziert werden (Schmidt et al. 2001, Fiedler et al. 2001). Neben dem bereits angesprochenem Locus C13orf19 wurde im Rahmen der Leukämieforschung ein weiteres Kandidatengen auf C13q14 identifiziert: DLEU7 (Hammarsund et al. 2003). Beide Gene verfügen über 5´ UTR, in denen sich CpG - Islands nachweisen lassen. Ziel dieser Studie war es, den Methylierungstatus der Promotoren dieser beiden Gene in Prostatakarzinomzelllinien, Tumorgeweben und Kontrollen (BPH, Lymphozyten) zu untersuchen. Abb.1 Auswahl von Genloci auf Chromosom 13q Abb.2 Epigenetisch veränderte Gene in verschiedenen Tumoren (Yegnasubramanian et al. 2004) Material und Methoden Zur Aufklärung der Methylierungsmuster kam die Bisulfitsequenzierung zum Einsatz, d.h. mittels Bisulfitumwandlung modifizierte DNA wurde sequenziert. Die Natriumbisulfit–Umwandlung ermöglicht eine methylierungsspezifische Sequenzmodifikation, wobei Cytosin in Uracil umgewandelt wird, 5´Methylcytosin hingegen unverändert bleibt (Abb.3). Dazu wurde der CpGenome DNA Modification Kit (Chemicon) verwendet. Die Güte der Umwandlungsreaktion wurde mit einer methylierungsspezifischen PCR für den beim Prostatakarzinom häufig methylierten GSTP1-Promoter (zum Nachweis vollständig umgewandelter DNA) sowie mit einer konventionellen PCR für p53 Exon 6 (zum Nachweis nativer DNA) getestet. Nur Proben, die in der p53–PCR kein Produkt lieferten, können als vollständig umgewandelt betrachtet und für weitere Analysen verwendet werden. Der Bisulfitumwandlung folgte die Amplifikation der interessierenden CpG-Inseln, wobei die Promoterregionen im Fall des C13orf19 in drei, im Fall des DLEU7 in zwei Abschnitte unterteilt wurden, die jeweils in einzelnen PCRs amplifiziert wurden. Das Primerdesign erfolgte mit Hilfe der DNA Star Primerselect Software. Die gewonnenen PCR-Produkte wurden gereinigt und zur Ligation und Klonierung mittels pGem T-Easy Vector System (Promega) und elektrokompetenten Zellen (Stratagene) eingesetzt. Nach erfolgter Transformation wurden die gewonnenen Plasmide mit dem Restriktionsenzym Eco R1 kontrollverdaut und – sofern ein Insert in erwarteter Länge enthalten war – als Template zur Sequenzierung eingesetzt. Die Sequenzierung erfolgte mit dem ABI PRISM Big Dye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit und, in Abhängigkeit von der Probe, mit Sp6- (Abb.4) oder T7– Primern. Die primäre Sequenzanalyse wurde vom automatischen Sequenziergerät ABI PRISM 310 durchgeführt, der Vergleich der erhaltenen Sequenzen erfolgte mit der DNA Star Seqman Software. Für die Analysen wurde DNA der Prostatakarzinomzelllinien LNCaP, 22Rv1, PC-3 und DU145 sowie von während der radikalen Prostatektomie intraoperativ in der hiesigen Klinik asservierten Gewebeproben eingesetzt. Des weiteren wurden als Kontrollen DNA der Prostataadenomzelllinie BPH1 und Lymphozyten-DNA eines gesunden Spenders verwendet. Zusammenfassung und Ausblick Zum Nachweis von Veränderungen des Methylierungsmusters des Gens C13orf19 wurden jeweils 10 Klone der 5 Zelllinien und der Lymphozyten DNA analysiert. Bei der Analyse der drei Fragmente des C13orf19-Promoters konnte weder in den PCa–Zelllinien, noch in den Normalgeweben, Blut (Lymphozyten-DNA) oder BPH (benigne Prostatahyperplasie) eine Hypermethylierung nachgewiesen werden (Abb.5). Auch die bisher untersuchten FF0-Klone der Kryogewebe-DNA zeigen keinen Anhalt für epigenetische Veränderungen (nicht dargestellt). Hingegen zeigt der DLEU7-Promoter im Prostatakarzinom Hypermethylierung. In beiden Fragmenten ist im Vergleich zum Normalgewebe (Blut, BPH) eine deutliche Zunahme an methylierten Cytosinen zu verzeichnen (Abb.6). Besonders deutlich werden die Unterschiede im Methylierungsstatus des Fragmentes DLEU7.2, betrachtet man die analysierte Kryogewebe-DNA. Während im nichtmalignen Gewebe 556Tf gerade 5 von 17 CGs methyliert sind, sind es im Karzinomstück 833TU alle 17, das Karzinomstück 822 TU zeigt ein abgestuftes Bild: mit 10 methylierten CGs liegt es zwischen 556Tf und 833TU. Beim Vergleich der Positionen der methylierten CGs fällt auf, dass alle in 556Tf methylierten Positionen neben 5 weiteren ebenso methyliert sind. Im weiteren Verlauf der Studie werden weitere Klone der Zelllinien und Tumorgewebe-DNA untersucht werden mit dem Ziel, die Methylierungsmuster hinreichend genau zu kartieren, um methylierungsspezifische PCRs auf der mit Bisulfit umgewandelten DNA zu etablieren. Hiermit wird es vergleichsweise einfach sein, ein größeres Patientenkollektiv auf epigenetische Veränderungen hin zu screenen. Abb.3 Prinzip der Bisulfitumwandlung Abb.5 Promoter des C13orf 19 in drei Fragmenten Bisulfit-sequenziert Abb.6 Promoter des DLEU7 in zwei Fragmenten Bisulfit– sequenziert Ergebnisse II Referenzen von Knobloch et al Hammarsund et al Schmidt et al Fiedler et al Dong et al Li et al Melamed et al Hosoki et al Wolter et al Fu et al Lin et al Yegnasubramanian et al Danksagung Diese Studie wird von der Wilhelm-Sander- Stiftung mit einer Sachbeihilfe gefördert. Nr LEGENDE: ○ unmethyliertes C ● methyliertes C Ergebnisse I Abb.4 Obere Sequenz: unmethylierte DNA in Gegenrichtung sequenziert/ untere Sequenz: methylierte DNA


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