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1 Roche Applied Science 21.09.04 9.00 – 12.30 Uhr Schülerkongress GBM-Tagung in Münster.

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1 1 Roche Applied Science – Uhr Schülerkongress GBM-Tagung in Münster

2 2 Roche Applied Science Tagesablauf 1. Einführung 5. Elektrophorese 45 min 2. Gelvorbereitung 30 min 6. Färben der DNA im Agarose- Gel 40 min 3. Schneiden des Plasmids 45 min 7. Auswertung 4. Vorbereitung der Proben für die 8. Vorstellung weiterer Ergebnisse Gelelektrophorese 20 min

3 3 Roche Applied Science Pipettenbedienung

4 4 Roche Applied Science Gelvorbereitung

5 5 Roche Applied Science Schneiden des Plasmids pUCD-lacZ mit BanII

6 6 Roche Applied Science Elektrophoretische Trennung der geschnittenen DNA

7 7 Roche Applied Science Escherichia coli Bewegliches Stäbchenbakterium Natürliches Habit: Intestinaltrakt von Warmblütlern (Darm) Wasserindikator für fäkale Verunreinigungen Haustier der Wissenschaft Verwendeter Stamm in Experimenten: Sicherheitsstamm K12 (JM109) Außerhalb Labor nicht lebensfähig (bestimmte Eigenschaften fehlen) Kein genetisch veränderter Mikroorganismus (natürliches Vorkommen des lacZ-Gens)

8 8 Roche Applied Science Weitere Bakterien Vibrio cholerae Leptospira ssp.Salmonella enteriditis Desulfovibrio sp.

9 9 Roche Applied Science Was ist DNA/DNS? DesoxyriboNucleinSäure Helikaler Doppelstrang 4 Basen Adenin, Thymin Guanin, Cytosin Gene: informationstragende Abschnitte für Proteinbiosynthese 1 Codon aus 3 Nukleotiden entspricht 1 Aminosäure

10 10 Roche Applied Science Proteinbiosynthese: Vom Gen zum Protein

11 11 Roche Applied Science Was sind Restriktionsenyzme? Proteine (Eiweiße) Schneiden DNA an spezifischen Erkennungssequenzen (oft Palindrome)

12 12 Roche Applied Science Was sind Plasmide? Schematische Karte des Plasmids pUCD-lacZ Amp r : Ampicillinresistenz-Gen Ori: Replikationsursprung Neben chromosomaler DNA oft zirkuläre DNA-Fragmente in Bakterien Sicherheitsplasmide: Keine Weitergabe von Zelle zu Zelle

13 13 Roche Applied Science Historie 1865Mendel 1869Miescher 1944Entdeckung der DNA als Trägersubstanz des Erbguts (Avery) 1953Entdeckung der doppelhelikalen Struktur der DNA (Watson und Crick) rekombinantes Bakterium von Boyer, Cohen und Chang 1977Gentransfer eines humanen Gens auf ein Bakterium (Insulingen) 1982Insulin als 1. gentechnisches Produkt auf Markt Gentransfer eines bakteriellen Gens auf eine Pflanze (Tabak) 1985PCR (Mullis) 1988Gründung von HUGO (Human Genome Project) 2000Entschlüssung des humanen Genoms von Craig Venter

14 14 Roche Applied Science Bedeutsamkeit Rekombinante Proteine in therapeutischen und diagnostischen Anwendungsgebieten: - RecHormon (Erythropoietin=blutbildendes Hormon) -- Reteplase (tPA=Plasminogen Aktivator ) -- Insulin -- Glucose Oxidase (Blutzuckermonitoring) -- Teststreifen für Urin

15 15 Roche Applied Science Analyse von DNA Agarosegel (molekularer Sieb): kleinere Fragmente wandern schneller als größere Fragmente durch das Agarosesieb. Negative Ladung => Wanderung im Spannungsfeld zur Anode (pos. Pol) Wanderungsgeschwindigkeit linearer doppelsträngiger DNA- Moleküle umgekehrt proportional zum Logarithmus ihrer Größe

16 16 Roche Applied Science Auswertung Vergleich mit bekanntem Bandenmuster DNA- Fragmente (DNA- Molekulargewichtsstandard) BanII schneidet 3x in Plasmid pUCD-lacZ (5669 bp) 3 Fragmente erwartet Berechnung der Größe anhand Plasmidkarte 2504 bp, 2116 bp, 1049 bp

17 17 Roche Applied Science erwartete Ergebnisse

18 18 Roche Applied Science Weitere Experimente von Blue Genes (2. Teil) Klonierung eines DNA-Fragments (= Einschleusung eines Gens in eine Bakterienzelle mit Hilfe eines Plasmids), Weitergabe an Nachkommen, 1 Klon entsteht: 1. Plasmidschneiden, Einfügen von Fragment, Ligation 2. Transformation in E.coli Sicherheitsstamm (nur 1 von nimmt Plasmid auf), dessen lacZ-Gen defekt ist 3. Selektion über Antibiotikum Ampicillin (Plasmid enthalten) und über X-Gal (Spaltung zu blauem Farbstoff, Gen erfolgreich eingeschleust)

19 19 Roche Applied Science Klonierung von DNA-Fragmenten

20 20 Roche Applied Science Tipps und Tricks zur Versuchsplanung Lagerungs- und Unterbrechungsmöglichkeiten: Restriktionsansatz nach Inkubation bei 37 °C mehrere Wochen bei – 20 °C 1x Elektrophoresepuffer mehrere Wochen bei RT Nicht verwendetes Gel eingepackt in Folie ca. 1 Woche im Kühlschrank Nicht verwendetes Gel in Elektrophoresekammer mit Puffer überschichtet 2 bis 3 Tage Proben bereits mit Elektrophoresepuffer versetzt mehrere Wochen bei – 20 °C Elektrophoresekammer mit Puffer gefüllt 2 bis 3 Tage Färbelösung in Flasche mit Alufolie verdunkelt mehrere Woche bei RT Gelaufenes Gel über Nacht in Wasser, ebenso gefärbtes (Achtung! Entfärbung!)


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