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Matthias P. Ebert II. Medizinische Klinik und Roman-Herzog-Krebszentrum Klinikum rechts der Isar TU München Bluttests - Alternativen zu Stuhltests ?

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1 Matthias P. Ebert II. Medizinische Klinik und Roman-Herzog-Krebszentrum Klinikum rechts der Isar TU München Bluttests - Alternativen zu Stuhltests ?

2  Molekulare Stuhltests  Molekulare Bluttests Darmkrebsdiagnostik

3 Adenom - Karzinom - Sequenz Nachweis möglich ?

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5 Ebert M and Opitz O, Gastroenterology 2009 Knudson’s Doppel Hit Hypothese sporadisch hereditär Mutation Methylierung Normal Tumor

6 aus Qiu, Nature 2006; 441, Methyl Histone Methyl Zwei Hauptkomponenten des epigenetischen Codes DNA Methylierung Histonmodifikationen

7 DNA Methylierung und Karzinogenese

8 aus Munten, Am J Pathol 2009 DNA Methylierung und Karzinogenese Normal Exon DNMT Exon DNMT Tumor Unmethyliertes Cytosin Methyliertes Cytosin

9 Mutation Methylierung

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11  Molekulare Stuhltests  Molekulare Bluttests Darmkrebsdiagnostik

12 ●Tumor DNA ins Blut abgegeben mit DNA Konzentrationen z.T. < 5 pg/ml (weniger 2 Genomkopien) ●Gesunde „Hintergrund“ DNA im Blut bei etwa 10 ng/ml Tumor DNA im Blut Widschwendter M, Clin Cancer Res 2006

13 Nachweis von Methylierung im Plasma C. Lofton-Day, Clin Chem 2008

14 Septin9 Test Training/Testing Study 2008 (n = 269) CE Study 2009 (n = 257) PRESEPT Study 2010 (n = 1511) All Studies Design case control prospective accumulate d Patient Stage positive/ tested % positive positive/ tested % positive positive/ tested % positive I 19 / / / II 60 / / / III 47 / / / IV 7 / / 9894 / All 133 / / / Controls 29 / 3279 (91)17 / (89)126/14589 (91) Fall-Kontroll-Studien: Sept9

15 Timothy R. Church, Michael Wandell, Catherine Lofton-Day, Steven J. Mongin, Brent A. Blumenstein, John I. Allen, Thomas Roesch, Neal Osborn, Dale Snover, Robert Day, and David F. Ransohoff for the PRESEPT Clinical Study Steering Committee, Investigators, and Study Team Prospective clinical validation of an assay for methylated Septin 9 DNA in human plasma as a colorectal cancer screening tool in average risk men and women 50 years and older

16 PRESEPT: Patienten Anzahl der Studienzentren: 32 Zentren Deutschland:10 Zentren USA:22 Patienten eingeschlossen:7,929 Ausgeschlossene Patienten (z.B. Diagnose unvollständig, Koloskopie inkomplett, Blutprobe nicht verwendbar): 813 Zustimmung zurückgezogen:9 Diagnose: anderes Malignom:6 Verfügbar für molekulare Analyse: 7,107 KRK identifiziert: 53 Mehr als 2/3 der 53 KRK in frühen Stadien (I und II) und viele Stadium I Karzinome waren pT1 Tumoren

17 PRESEPT Studie: Ergebnisse Spezifität 91% Sensitivität 51% –Hohe Rate von frühen Tumorstadien (Screening- Population) –Geringe Gesamtzahl von Tumoren (grosses Konfidenzintervall) n = 53n = 1458

18 Septin9 Test Training/Testing Study 2008 (n = 269) CE Study 2009 (n = 257) PRESEPT Study 2010 (n = 1511) All Studies Design case control prospective accumulate d Patient Stage positive/ tested % positive positive/ tested % positive positive/ tested % positive I 19 / / / II 60 / / / III 47 / / / IV 7 / / 9894 / All 133 / / / Controls 29 / 3279 (91)17 / (89)126/14589 (91) Comparison of PRESEPT and Previous Case Control Study Results

19 PRESEPT Studie: Schlussfolgerung m SEPT9 Biomarker im Rahmen einer prospektiven Studie erfolgreich validiert >50% Sensitivität (entspricht Vorgaben der Amerikanischen Krebsgesellschaft) >85-90% Spezifität SensitivitätSpezifität PRESEPT (2-PCR replicate) 51% [37.7% – 64.2%]91% [89.9 – 92.8] PRESEPT (3-PCR replicate) 67% [53.8% – 78.8%]88% [86.8% %]

20 Neue Strategie ? Molekularer Nachweis von Adenomen

21 tissue factor pathway inhibitor 2 Cancer Res 2009 Gewebe

22 Ebert et al, Gastroenterology 2006 ALX4 Methylierung im Adenom

23 Normal Cancer AUC=0.839 p< SensitivitätSpezifität 0.03 pg/ml90%53.3% 41.4 pg/ml83%70% x10 2 pg/ml (n=30) Ebert et al, Gastroenterology 2006 ALX4 Methylierung beim KRK: Plasma

24  Polypen: n=49 –> 1cm Polyp mit aIEN n=7 Tubulovillöses Adenom-2 Tubulares Adenom-5 –> 1 cm Adenom, ohne aIEN n=9 –< 1 cm Adenom, ohne aIEN n=17 –< 1 cm Adenom, mit aIEN-3 (alle tubulovillös) –Hyperplastische Polypen n=13 <1 cm-11 >1 cm-2  CRC: n=5 –Stadium I-4 –Stadium III-1  Negativ: n=22 ALX4 Methylierung im Plasma: Adenome

25 PolypenZahl der Proben SEPT9 2/3ALX4 2/3SEPT9 or ALX4 2/3 SEPT9 + ALX4 3/6 #%#%#%#% > oder = 1 cm $,* 7212 * 67 < 1 cm * 4212 * 39 Hyperplastisch x6x 4x4x 31 Tubuläres oder tubulovillöses Adenom-alle Grössen § 5520 * 55 Tubuläres oder tubulovillöses Adenom, > 1cm § 6911 * 69 Tubuläres oder tubulovillöses, >1cm + aIEN §6§ 866*6* Normale Kontrollen ALX4 Methylierung im Plasma: Adenome Tanzer et al, Plos One 2010

26 PolypenZahl der Proben SEPT9 2/3ALX4 2/3SEPT9 or ALX4 2/3 SEPT9 + ALX4 3/6 #%#%#%#% > oder = 1 cm $,* 7212 * 67 < 1 cm * 4212 * 39 Hyperplastisch x6x 4x4x 31 Tubuläres oder tubulovillöses Adenom-alle Grössen § 5520 * 55 Tubuläres oder tubulovillöses Adenom, > 1cm § 6911 * 69 Tubuläres oder tubulovillöses, >1cm + aIEN §6§ 866*6* Normale Kontrollen ALX4 Methylierung im Plasma: Adenome

27 EPITEK - Projekt Fragestellung Erlaubt die Bestimmung von epigenetischen Markern im Blut die Prädiktion von Vorläuferläsionen des kolorektalen Karzinoms ?

28 EPITEK – Studie (Epigenetischer Screening-Test für Kolorektale Adenome) 2000 Vorsorgekoloskopien Adenome mMARKER

29 Epigenomics Biomarkeridentifizierung Assay Entwicklung Prof. M. Ebert/TUM Probenaufarbeitung und -Sammlung Assays Study Office EPITEK KVB Koordination Gastro-Partner Dokumentation Befunde Marker Proben Daten

30 Blut 3 Phasen der EPITEK Studie 20 Marker 3-4 Marker 2 Marker Gewebe Marker Selektion Studie I EPITEK Studie nach Darmspiegelung vor Darmspiegelung

31  Der molekulare Nachweis genetischer und epigenetischer Veränderungen im Stuhl und Blut ist geeignet Kolonkarzinome nachzuweisen  Die meisten Veränderungen wurden bislang in kleinen und retrospektive Serien untersucht  Erstmalig Validierung eines Tests in einer prospektiven Studie (Sept9)  Wissenschaftliche Studien befassen sich zukünftig mit der nichtinvasiven Detektion von Vorläuferläsionen (EPITEK) Bluttests als potente Alternativen zu Stuhltests ?

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