1 Standardisierung und Etablierung einer in vitro- Methode zur Schätzung der Phosphorverdaulichkeit beim Schwein D. Petri, Saskia Kehraus, K.-H. Südekum.

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1 1 Standardisierung und Etablierung einer in vitro- Methode zur Schätzung der Phosphorverdaulichkeit beim Schwein D. Petri, Saskia Kehraus, K.-H. Südekum Institut für Tierwissenschaften Universität Bonn 119. VDLUFA-Kongress, Göttingen, 18.-21. September 2007

2 2 1. Einleitung

3 3 P-Bewertung von Futtermitteln beim Schwein Europa: P-Bewertung nach dem System des verdaulichen Phosphors (vP) Differenz-Fütterungsversuche bei P- Knappheit in der Ration (GfE, 1994) Analytische Bestimmung des Gesamt-P- Gehalts in Futtermitteln und Kot vP = Differenz Aufnahme - Ausscheidung im Kot (%) Große Genauigkeit bei hohem Aufwand

4 4 P-Bewertung von Futtermitteln beim Schwein Nordamerika: P-Bewertung nach dem System des bioverfügbaren Phosphors (aP) Differenz-Fütterungsversuche bei P- Knappheit, als Referenzgröße dient eine hochverdauliche P-Quelle (z. B. Mono- Natriumphosphat) Analytische Bestimmung des Gesamt-P Bestimmung des Mineralisierungsgrads der Knochen (Bruchfestigkeit/Rohasche-Gehalt) aP wird angegeben in % des Gesamt-P- Gehalts

5 5 In vitro „Test Tube“(TT)-Methode BOLLINGER et al. entwickelten 2004 eine in vitro-Methode zur Schätzung des aP-Gehalts Nach drei enzymatischen Verdauungsstufen, die die Verdauung des Schweins nach- empfinden, wird der Gehalt an hydrolysiertem P aus dem Futtermittel photometrisch gemessen Enzymkonzentrationen, Dauer der Enzym- behandlung und die Einwaagemenge wurden mit Hilfe einer vollständig randomisierten ANOVA getestet

6 6 2. Standardisierung der Methode

7 7 Überlegungen In vitro-TT-Methode nach BOLLINGER et al. (2004) simuliert die Verdauung im Schwein Korrelation mit Ergebnissen aus Fütterungsversuchen zur vP-Bestimmung GfE (1997): Methode zur in vitro-vP- Schätzung wünschenswert, da Aufwand für Fütterungsversuche sehr hoch und Datenbasis der Empfehlungen relativ schmal

8 8 Rekonstruktion und Weiter- entwicklung der TT-Methode Das von BOLLINGER et al. verwendete Produkt Natugrain ® wird nicht mehr produziert: Nachfolgeprodukt Natugrain ® TS (NatTS) Die Angaben zur photometrischen Messung waren ungenau (BOLLINGER et al. 2004, 2005) Evaluierung der in vitro-Methode an 5 in vivo geprüften Erbsensorten (KLUTH et al. 2004) sowie reinem Na-Phytat und minerali- schem Mono-Na-Phosphat

9 9 Einwaage Einwaage von 250,0 mg ± 0,2 mg

10 10 Enzymatische Verdauung Vorverdauung: 3 ml 0,04%-ige NaN 3 -Lösung mit 5,3 mg/ml NatTS NatTS: Endo-Xylanase und Endo- β -Glucanase Erhöht die Kohlenhydratverdaulichkeit, beugt Gelbildung vor Pepsinverdauung: 1 ml 0,85 N HCl-Lösung mit 24.000 U/ml porcinem Pepsin Endopeptidase: Proteine  Peptide, Freisetzung des P aus der Matrix, Simulation des Magens des Schweins Pankreatinverdauung: 1,3 ml 0,8 M NaHCO 3 -Lsg. mit 22,6 mg/ml porcinem Pankreatin Enzymgemisch (Amylasen, Proteasen, Lipasen) aus der Bauchspeicheldrüse des Schweins, Simulation des Dünndarms (Schüttelwasserbad bei 39 °C, 120 rpm, 1 [Vorverdauung] bzw. 2 h)

11 11 Verdauungsstopp Eiswasserbad (reversibel) 20 ml 2 N HCl (irreversibel)

12 12 Zentrifugation, Färbung & photometrische Messung Zentrifugation bei 1000 x g (20 min) Aliquot: 2 - 6 ml aus dem klaren Überstand Anfärben des hydrolysierten P mit Hilfe von Vanadium-Molybdat-Komplexierung Auffüllen auf 50 ml Zentrifugation bei 3000 x g (5 min) Photometrische Messung bei 415 nm

13 13 3. Ergebnisse

14 14 P-Verdaulichkeitskoeffizienten In vitro In vivo (Literatur) n P (g/kg TM) nvPSDvPSD NaPhyt - 197.9 15 0.045 0.001 0.15 Erbsensorte Avia 4 4.2 15 0.347 0.034 0.322 0.081 Laser 3 4.6 15 0.301 0.040 0.363 0.045 Madonna 4 4.7 15 0.241 0.029 0.423 0.168 Miami 4 4.9 15 0.336 0.032 0.440 0.077 Swing 4 4.5 15 0.335 0.020 0.424 0.061 MNaP - 285.1 15 0.659 0.012 0.96 TM, Trockenmasse; vP, Verdaulichkeitskoeffizient für Phosphor; SD, Standardabweichung

15 15 Lineare Beziehung: Verdaulicher P (vP) in vitro versus in vivo Lineare Regression (p > 0.95 Konfidenzintervall): Y in vivo = (1.288 ± 0.215) * X in vitro + (0.0237 ± 0.0785); R² = 0.878, r = 0.937. vP in vivo vP in vitro A Na-Phytat B Avia C Laser D Madonna E Miami F Swing G Mono-Na- Phosphat

16 16 4. Diskussion der Methode

17 17 Stärken Im Gegensatz zum Fütterungsversuch: Schnell, effizient, kostengünstig Trotz geringer Anzahl der zur Evaluierung zur Verfügung stehenden in vivo-vP-Proben enge Korrelation in vivo zu in vitro ( r = 0,937) Ausreichende Wiederholbarkeiten zwischen den Bestimmungen (relative Ø Standardab- weichung über alle Analysen und Bestimmungen: 5,6 %)

18 18 Schwächen Für eine analytische Methode (zu) aufwendig, fehleranfällig und zeitintensiv Hohe Ausschussquote: vor allem Schwebe-- teilchen verfälschen bei der photometri- schen Messung sehr schnell das Messer- gebnis Keine Unterbrechungsmöglichkeiten während der Bestimmung

19 19 Weiterentwicklung Anpassung der Einwaage an den vermuteten Gehalt an vP Mischung der Enzymlösungen mit dem Probenmaterial verbessern Vermeidung von Schwebeteilchen in der Messlösung: Filtration, mehr 2N HCl zugeben, schneller Zentrifugieren

20 20 5. Anwendung

21 21 Schätzung des vP von Getreide- schlempe (getrocknet) Getreideschlempe: ProtiGrain ® als Koppelprodukt der Bioethanolherstellung Es besteht aus etwa 10 % Gerste und 90 % Weizen Analysen an ProtiGrain ®, Weizen, Gerste

22 22 P-Verdaulichkeiten In vitro In vivo (Schätzung) In vivo (Literatur) n P (g/kg TM) nvPSDvPSDvP ProtiGrain ® 39.39 17 0.469 0.016 0.627 0.044 - Wheat 33.03 18 0.414 0.033 0.557 0.066 0.68 ± 0.06 Barley 33.76 18 0.357 0.027 0.483 0.059 0.45 ± 0.11 TM, Trockenmasse; vP, Verdaulichkeitskoeffizient für Phosphor; SD, Standardabweichung

23 23 6. Fazit In vitro-Methode zur Schätzung der P- Verdaulichkeit beim Schwein etabliert, standardisiert und angewendet Bestimmtheitsmaß der linearen Regression zwischen in vitro- und in vivo-Verdaulich- keiten des P von 88 % Bisher wenig Vergleichsmaterial in vivo Gehalte an vP in Futtermitteln für Schweine schnell und genau bestimmen Sicherheitszuschläge bei der vP-Bewertung abbauen und die Datengrundlage erweitern

24 24 Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!