Molekulargenetische AB0-Typisierung Dr. G. Heymann

Einsatzgebiete Serologische Bestimmung ist unmöglich: Vortransfusion KMT Serologie ergibt unklare Ergebnisse Pränataldiagnostik Familienstammbaum wissenschaftliche Fragestellungen

Bisherige Fragestellungen Antigenseite paßt nicht zur Serumseite schwaches Antigen? Serumseite paßt nicht zur Antigenseite multiple Vortransfusion auffälliger Bed-side Test Neugeborenes / Mutter Chimärismus

Bisherige Fragestellungen II Von 157 ausgewerteten Untersuchungen betrafen 57 (36%) AB0-System im Vergleich: Rhesus 80 (51%), HTLA 11 (7%), andere (MNS, K, Fy, Jk) 9 (6%) Im AB0-System konnten 67% problemfrei aufgeklärt werden. Weitere 16% ergaben bedingt ein Ergebnis.

Bisherige Fragestellungen III Ca. 25%

Generelle Probleme Nachweis eines Polymorphismus der AB0-Transferase ist nur indirekte Blutgruppen-bestimmung. Bestimmung einer Variante basiert allein auf dem Ausschluß von „Unnormalem“. Molekulargenetische Nomenklatur ist uneinheitlich und nicht mit Serologie vergleichbar.

AB0-Blutgruppen

AB0-Blutgruppen N-Acetylgalaktosamin an verzweigten Ketten

Sequenzen Exon 6 Exon 7 Spezifisch für 0 Spezifisch für B A104 A204 Ax02 0o8 0o9 A102 A103 Ael02 0o3 A204 A206 0o9 A203 024 A204 A206 Spezifisch für B Spezifisch für B Spezifisch für B 0o8 A302 Aw02 Aw03

Prinzip der PCR-SSP Genomischer DNA-Doppelstrang bei Erhitzung auf >92°C denaturiert.

Prinzip der PCR-SSP Primerannealing bei 37 - 72°C 5´ 3´ 3´ 5´ Antisenseprimer 3´ 3´ Senseprimer 5´

Prinzip der PCR-SSP Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis PCR-Cyclen beendet. 5´ 3´ 3´ 5´

Auflösungsvermögen Die PCR-SSP erkennt (nur!?) bekannte Varianten Watanabe 8 Mixe A/01,B/01,01,01,02,B,A2,Alle(A2) Kommerziell 8 Mixe 01, n01, 02, n02, B, nB, A2, nA2 InnoTrain, BAG Eigene PCR 48 Mixe Hannover 96 Mixe Ausschluß um so besser möglich, je mehr Varianten erkannt werden.

Besondere Befunde Pruß A, Heymann GA et al Besondere Befunde Pruß A, Heymann GA et al., Acute intravascular hemolysis after transfusion of a chimeric RBC unit. Transfusion 2003; 43: 1449-51

Besondere Befunde Spenderin wurde initial als B bestimmt. Beim Bed-side Test aus Konserve fiel ein schwaches A auf. 523 526 721

Prinzip der Sequenzierung Primerannealing bei 37 - 72°C nach Denaturierung 5´ 3´ Sequenzierprimer 3´ 5´

Prinzip der Sequenzierung Elongation durch Taq-Polymerase bei 72°C bis Kettenabbruch Wiederholung Denaturierung, Annealing und Elon- gation, bis Cyclen beendet. Es entstehen verschieden lange Ketten, die aufgetrennt werden können. 3´ 5´

Nondeletionale 0 Allele A. Seltsam, Arbeitsgruppentagung, Hannover 2004 Es gibt AB0-Transferase, die keine Deletion an 261 zeigen, jedoch eine große Anzahl von Mutationen aufweisen. Diese „0-Allele“ zeigen kaum Aktivität. Es kommt jedoch, zumindest bei 0o3, zu einer nachweisbaren Menge von A auf den Erys. Dies reicht aus, um Isoagglutinine zu supprimieren. Bisher hier 4 Fälle mit antigenseitig 0, serumseitig A.

Nomenklatur Die Allele wurde v.a. nach der serologischen Reaktivität der Erstbeschreibung benannt. Diese deckt sich fast nie mit der Reaktivität der gleichen Allele bei späteren Patienten. Beispiele für Benennung: 0o1: auch 01, 0a 0o6: auch 0v1, 0tlse1 A201: auch A105, A2, Aw-1 cisAB01: auch C101 Von 3 Ael Verdachtsfällen waren bisher 2 Ax01 und 1 A104, keines Ael01(A109, Ael1) oder Ael02(A110, Ael2).

Besonderheit: 1 Transferase = 2 Antigene Es gibt Allele, die eine Konjugierung mit Gal und N-Ac-Gal gleichermaßen vermitteln. Phänomen des Cis-AB

Kosten Pro Primer 0,02 Euro 60 versch. Primer =1,20 Euro Für Platin Taq 3,56 Euro Für PCR-Puffer 1,- Euro Gel, Photo, Puffer 1,50 Euro DNA-Isolierung 3,- Euro kommerziell (BAG) 250,-Euro / 10 Tests pro Test In House ca. 10,- Euro kommerziell ca. 30,- Euro (weniger Verbrauchsmaterial) Dauer: min. ca. 3 h

Fazit Die Fragestellung entscheidet essentiell über den Aufwand, der betrieben werden muß. Die Ursache für serologisch unklare AB0-Bestimmungen ist nur in seltenen Fällen eine Mutation. Es ist meist keine direkte Aussage zur vermutlichen serologischen Reaktivität möglich.

Literatur zum Nachlesen Zur PCR: Watanabe et al. Human Genetics 1997;99;34-37 Yip. Blood 2000;95;1487ff Gassner et al. Blood 1996; 88; 1852-1856 Zu einzelnen Allelen: Yamamoto et al. Vox sanguinis 1993; 64; 116-119 und 171-174 und 175-178 Yamamoto et al. Vox sanguinis 1995; 69; 1-7 Olsson et al. Blood 2001; 98; 1585ff Im Internet: Blood Group Antigene Gene Mutation Database: http://www.bioc.aecom.yu.edu/bgmut/abo.htm