Multiplex-RT-PCR-ELISA © W. Puppe

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Akuten Infektionen des Respirationstraktes UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Mikrobiologische Labor der Kinderklinik Nachweis von Erregern bei Akuten Infektionen des Respirationstraktes © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - Nachweis viraler RNA durch reverse Transkription mit anschließender Polymerase Chain Reaction © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer Zielsequenz (RNA) Reverse Transkriptase © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer ACGGTCTTG Zielsequenz (RNA) © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe d-ATP d-CTP d-GTP d-TTP Primer ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTACGGTGTTGTA Zielsequenz (RNA) © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe ERGEBNIS c-DNA Primer ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTACGGTGTTGTACACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 1 Kopie c-DNA © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction c-DNA denaturieren bei 94°C © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction c-DNA denaturieren bei 94°C © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction annealen von spezifischen Amplifikations-Primern an Einzel-Strang 50°C 5‘ 3‘ Primer 2 Primer 1 © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription durch Taq-Polymerase 72°C Taq-Polymerase 5‘ 3‘ Primer 2 CA d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription durch Taq-Polymerase 72°C Taq-Polymerase 5‘ 3‘ Primer 2 CTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription durch Taq-Polymerase 72°C 1. Zyklus 1 Kopie Taq-Polymerase 5‘ 3‘ Primer 2 TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA d-ATP;d-CTP; d-GTP; d-TTP © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Denaturieren 94°C 2. Zyklus 5‘ 3‘ TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Denaturieren 94°C 2. Zyklus 3‘ 5‘ TGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction annealing der Primer 50°C 2. Zyklus 5‘ 3‘ Primer 2 d-ATP; d-CTP; d-GTP; d-TTP Primer 1 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription mit Taq-Polymerase 72°C 2ter Zyklus 5‘ 3‘ Primer 2 TGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription mit Taq-Polymerase 72°C 2ter Zyklus 5‘ 3‘ Primer 2 CATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAG CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Transkription mit Taq-Polymerase 72°C 2ter Zyklus 5‘ 3‘ Primer 2 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction nach dem 2ten Zyklus 2 Kopien 5‘ 3‘ CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 3ter Zyklus 94°C CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 3ter Zyklus 50°C Primer 2 Primer 1 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 Primer 1 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 3ter Zyklus 72°C Primer 2 ACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAAT CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 ACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAAT CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 3ter Zyklus 72°C Primer 2 ACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGAT CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 ACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGAT CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction 4 Kopien nach 3tem Zyklus 72°C Primer 2 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction nach dem 4ten Zyklus 8 Kopien CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction nach dem 5ten Zyklus 16 Kopien © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit eines Fragmentes welches auf der Zielsequenz UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit RT-PCR RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction in der Praxis erhält man nach 21 bis 31 Zyklen 106 bis 109 Kopien eines Fragmentes welches auf der Zielsequenz mit einem hoch spezifischen Primer Paar amplifiziert wurde © W. Puppe

Multiplex-RT-PCR Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR Multiplex-RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction Verwendung von 14 + 5 Primer Paaren die spezifisch für hoch konservierte Zielsequenzen der 19 Erreger sind in einem RT-PCR-Ansatz © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR m-RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction - Analyse der amplifizierten Fragmente im Agarosegel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 2% Agarose 501 404 331 242 190 147 140 bp 3. entero virus (154) 4. M. pneumoniae (277) 5. Inf A (190) 6. Inf B (249) 1. standard 2. negative controle 7. adenovirus (134) 8. C. pneumoniae (463) 9. PIV1 (179) 10. PIV3 (205) 11. RSV (239) 12. B. pertussis 13. B. parapertussis Ergebnis einer m-RT-PCR © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR m-RT-PCR - reverse Transkription der RNA in der Probe - anschließende Amplifikation mit Polymerase Chain Reaction - Analyse der amplifizierten Fragmente im Agarosegel - Spezifizierung der Amplifikate im PCR-ELISA © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - Einbau von DIG-11-dUTP ( ) in die Amplifikate bei der PCR d-UTP Transkription mit Taq-Polymerase 72°C 5‘ 3‘ d-UTP GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 GCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA d-UTP d-UTP Primer 1 ACGGUCTTGCAATGCGTGUACCGTAC-------ACGTAG CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT d-UTP d-UTP GAGAGACGGTCTTGCAATGCGTGTACCGTAC-------ACGTAGACGATGGACCATGTGACGTAAGGTAATTA Primer 2 GCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCA Primer 1 ACGGUCTTGCAATGCGTGUACCGTAC-------ACGTAG CTCTCTGGCAGAACGTTACGCACATGGCATG-------TGCATCTGCTACCTGGTACACTGCATTCCATTAAT 3‘ 5‘ d-UTP © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert ) GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte - Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym ) GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte - Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym ) - Zugabe von Substrat GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - DIG-11-dUTP markierte Fragmente aus der PCR - alkalische Denaturierung - Hybridisierung mit spezifischer Sonde (Biotin markiert) - Bindung an Strepavidin beschichtete Mikrotiterplatte - Antikörper gegen DIG (Konjugat mit Enzym ) - Zugabe von Substrat Farbentwicklung GATAGTAACTCACUGTTTGTTAACATGTAAGTGCTTAAAGGTGTUGTTACACCTGCATTGACACTGAATTCTCTGGTGATTTCCAACAATCTGCUGTTCTTCTGCTGGAATUCTATAACTGTTT GGACGTAACTGTGACTTAAG © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - Ergebnis eines m-RT-PCR -ELISA (Mikrotiterplatte) RSV Sonde Ev-Sonde Mp-Sonde InfA-Sonde InfB-Sonde Ad-Sonde Cpn-Sonde PIV3-Sonde PIV1-Sonde Enterovirus M. pneumoniae Influenza A Influenza B Adenovirus C. pneumoniae PIV1 PIV3 RSV neg. Präparation Kontrollen © W. Puppe

Nachweis von Erregern mit UK-SH / Campus Kiel Allgemeine Pädiatrie Pädiatrische Infektiologie Christian Albrechts Universität zu Kiel Nachweis von Erregern mit multiplex-RT-PCR RT-PCR-ELISA - Ergebnis eines m-RT-PCR -ELISA (Mikrotiterplatte & Gel) RSV Sonde Ev-Sonde Mp-Sonde InfA-Sonde InfB-Sonde Ad-Sonde Cpn-Sonde PIV3-Sonde PIV1-Sonde Enterovirus M. pneumoniae Influenza A Influenza B Adenovirus C. pneumoniae PIV1 PIV3 RSV neg. Präparation Kontrollen 2% Agarose 501 404 331 242 190 147 140 bp PIV1 (179) PIV3 (205) RSV (239) Cpn (463) Av (134) InfB (249) InfA (190) Mpn (277) Ev (154) © W. Puppe

Multiplex-RT-PCR-ELISA © W. Puppe

Multiplex-RT-PCR-ELISA © W. Puppe

Multiplex-RT-PCR-ELISA © W. Puppe

Multiplex-RT-PCR-ELISA © W. Puppe