Molekulargenetische Diagnostik Segregationsanalysen (indirekte Diagnostik) monogene Erkrankung (Retinoblastom) genetisch heterogene Erkrankung (multiple kartilaginäre Exostosen) DNA-Sequenzanalyse (direkte Diagnostik) (Tricho-Rhino-Phalangeales Syndrom) MLPA (direkte Diagnostik, Retinoblastom) (D. Lohmann) H.-J. Lüdecke

Retinoblastom

Familienanamnese bei Retinoblastom Familie L.B. Familie J.W. Familie L.S.

Erbliches Retinoblastom Keimbahn konstitutionell Tumor erste Mutation zweite Mutation rb X RB RB rb rb rb rb RB Gameten

Retinoblastomgen Genomische DNA 1 2 3 6 7 17 18 27 5´ 3´ Intron Exon Beispiele für Mutationen in kodierenden Bereichen

Segregation

Indirekte Diagnostik: Segregation gekoppelter Marker

VNTR-Polymorphismus 5´ 3´ 14801 ggtgtacgtc tatacagggc tatgtataac cgactcctgt ttctcctccc 14851 tgcaaccaca gaaccatcac acacacacac acacacacac acacacacac 14901 acacacacac acacggatac acgcacagat acgctccttt ccacaaatgc 14951 acgcaaaccg ggacgcaaac ccacaactcg agggcttaga ccttcactgc

Intragene VNTR-Loci D13S153 (RBi2) RB1.20 VNTR-Loci 5´ 3´ D13S153 (RBi2) RB1.20 VNTR-Loci ... CA ... ... GT ... ... CTTT ... ... GAAA ... n n

Genotypisierung RB1, väterliches Allel RB1, mütterliches Allel CA GT 20 CTTT GAAA 14 CA GT 18 CTTT GAAA 19

Kopplungsphase RB1, mutiert 4bp Deletion Exon 4 CTTT GAAA 14 CTTT GAAA 19

Kopplungsphase Rb1.20- Genotyp 15-18 14-20 14-18 18-20 14-16

Kopplungsphase Rb1.20- Genotyp 15-18 14-20 14-18 18-20 14-16 4bp Deletion Exon 4 CTTT GAAA 14

Analyse von VNTR-Loci PCR oder 5´ 3´ PCR oder Fragmentlängenanalyse durch elektrophoretische Auftrennung

Gelektrophorese

Agarosegel in Elektrophresekammer Anode (–) Kathode (+)

Auftragen der Proben

Elektrophoretische Auftrennung

Dokumentation per Videobild

Dokumentation

Genotypisierung Rb1.20- Genotyp 2-4 1-5 1-4 4-5 I-1 I-2 II-2 II-3 1-3

Familie I 1 1 1 1

Familie I 1-2 2 1 2 2 2 2 2 2 2 2

Familie I 1-2 3 2-3 1 2-3 3 3 2-3 3 3 3 3 3 3

Familie I 1-2 3-4 2-3 1-4 2-3 3 3 2-3 4 4

Familie I 1-2 3-4 2-3 1-4 2-3 3-5 3-5 2-3 5 5

Familie I 1-2 3-4 2-3 1-4 2-3 3-5 3-5 2-3

Familie 2 1-3 2-3 1-3 2-3

Familie 3 3 1-4 4-5 2-4 1-5 3-4 1-5 2-4 4-4

Familie 4 4 2-4 2-3 2-4 3-4 1-3 2-4 2-3

Prädiktive Diagnostik bei Locusheterogenität Segregationsanalyse bei hereditären multiplen cartilaginären Exostosen (HME) Hermann-Josef Lüdecke

Lokalisierung der Exostosen

Multiple cartilaginäre Exostosen Häufigkeit 1 : 50.000 Penetranz  100 % autosomal dominant genetisch heterogen 8q24.1 EXT1 11p11-12 EXT2 (19p EXT3)

Spektrum der Mutationen in EXT1 und EXT2 Wuyts & van Hul, 2000

und Segregationsanalyse mit EXT1- bzw. EXT2- intragenen Kopplungsanalyse und Segregationsanalyse mit EXT1- bzw. EXT2- intragenen Mikrosatelliten-Markern

genomische Organisation des EXT1-Gens

Kopplungsphase: EXT2, Allel 2 kein Risiko Risiko: M P P P GP P P P 1 2 3 4 5 P P GP P M P P P Kopplungsphase: EXT2, Allel 2 Risiko: kein Risiko

Übungsaufgaben

P 1 2 3 4 P P EXT1, Allel 2 kein Risiko für III2

1 2 3 P P P P keine Aussage möglich

1 2 3 4 5 P P P EXT2, Allel 2 Individuum III2 wird erkranken

Fehlen paternaler EXT1-Allele M P P ? ? M M M P P P M Fehlen paternaler EXT1-Allele

y935A12 y960B10

der(5) der(5) 5 5 8 der(8) Sonde: "paint 5" Sonde: y960B10

Molekulargenetische Diagnostik durch DNA-Sequenzanalyse

Punktmutationen THE CAT DID EAT THE RED HAT THE RAT DID EAT THE RED HAT THE ATD IDE ATT HER EDH AT THE CHA TDI DEA TTH ERE DHA T

1. Enzymatische Vermehrung des zu untersuchenden Genabschnittes mittels PCR Cave: Es werden immer das maternale und paternale gemeinsam amplifiziert!

2. Enzymatische Sequenzierung nach Sanger Template (Matrize) 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' Primer (Startmolekül) 5'-AAGTCATTGC-3' Primer-Annealing (Anlagerung) 5'-AAGTCATTGC-3' 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' DNA-Polymerase dNTPs ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP Primer-Verlängerung und Kettenabbruch

Enzymatische Sequenzierung nach Sanger Template (Matrize, einzelsträngig) 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' Primer (Startmolekül) 5'-AAGTCATTGC-3' Primer-Annealing (Anlagerung) 5'-AAGTCATTGC-3' 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' DNA-Polymerase dNTPs ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP Primer-Verlängerung und Kettenabbruch 5'-AAGTCATTGC TACGTAACT 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' 5'-AAGTCATTGC TACGTAACTG 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' 5'-AAGTCATTGC TACGTAACTGA 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' 5'-AAGTCATTGC TACGTAACTGAC 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5'

Enzymatische Sequenzierung nach Sanger hier sind einmal alle Produkte der Primer-Verlängerung gezeigt: 5'-AAGTCATTGC-3' 3'-TTCAGTAACGATGCATTGACTGTACTAGGAGCGCGTAC-5' DNA-Polymerase dNTPs ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP Primer-Verlängerung und Kettenabbruch 5'-AAGTCATTGCT 5'-AAGTCATTGCTA 5'-AAGTCATTGCTAC 5'-AAGTCATTGCTACG 5'-AAGTCATTGCTACGT 5'-AAGTCATTGCTACGTA 5'-AAGTCATTGCTACGTAA 5'-AAGTCATTGCTACGTAAC 5'-AAGTCATTGCTACGTAACT 5'-AAGTCATTGCTACGTAACTG 5'-AAGTCATTGCTACGTAACTGA usw.

Gelelektrophorese Kapillarelektrophorese

manuelle Beladung der Gele automatische Beladung der Kapillaren

Patient A G C T N CGA TGA Normalperson A G C T

Tricho-Rhino-Phalangeale Syndrome 8 Klinische Zeichen: dünnes, spärliches Kopfhaar große, "birnenförmige" Nase langes, flaches Philtrum schmales Oberlippenrot Zapfenepiphysen Brachydaktylie Hüftveränderungen Kleinwuchs multiple cartilaginäre Exostosen (nur TRPS II) TRPS1 EXT1

Tricho-Rhino-Phalangeales Syndrom An dieser Stelle wurde im Praktikum das Foto einer Patientin gezeigt. Dieses darf jedoch nicht im Internet veröffentlicht werden. Ich hoffe, Sie haben sich die Charakteristika des TRPS einprägen können.

Struktur des TRPS1 Transkriptionsfaktors 3 4 5 6 7 N C Exon 6

Sequenzierung von Exon 6 des TRPS1-Gens CGA  CAA; Arg  Gln; R  Q

Übungsaufgaben

Patient 1 Normalperson C G T A N A C C C G G T G T T T T T T G T G C C

Patient 1 Normalperson C G T A N A C = Thr = Pro C C G G T G T T T T T

Struktur des Zinkfingers vom "GATA"-Typ R R R G S G V F C A N L T K S W R G Y V G L Y Q K L H S Zn P NH2 COOH

aus: Vilain et al. (1999) Am J Med Genet 85:495-497

Patient 2 C A G T N Normalperson C A G T

Patient 2 Normalperson C A G T N Wildtyp: G T C A mutant: T G C A C A T-Insertion C A G T

Patient 3 C T G A N T A = Stop Normalperson C T G A

Patient 4 A G C T N g t a Normalperson A G C T

RNA - Spleissen Wildtyp Mutation eines Spleiss-Signals

N C 3 4 5 6 7 Wildtyp-TRPS1 IVS6+1G>T  exon6-TRPS1 1281 aa

Multiplex Ligation-dependent Probe Amplication (MLPA)

SALSA MLPA probes

Beachte den Unterschied Hybridisierung Der MLPA Sondenmix wird zu denaturierter genomischer DNA gegeben Die zwei Teile jeder Sonde hybridisieren mit benachbarten Zielsequenzen Beachte den Unterschied

Ligation 3. Die Sonden werden mit Hilfe einer thermostabilen Ligase verbunden (ligiert)

Fluoreszenzfarbstoff Amplification Mit einem universellen Primerpaar kann man alle ligierten Sonden amplifizieren Das Amplifikationsprodukt jeder einzelnen Sonde hat eine genau definierte Länge (92 - 481 bp). Fluoreszenzfarbstoff

bp NP1 NP2 Patient 1 Patient 2 Patient 3 1 10 20 30 40