Praktikum der Mikrobiologie 3. Kursstunde Untersuchungsmethoden zur Chemoresistenz (Antibiotikaresistenz)

3. Kursstunde Untersuchungsmethoden zur Chemoresistenz (Antibiotikaresistenz) ZNS-Infektionen Sepsis-Diagnostik

Praktikumsaufgaben I - Auswertungen - O / F / B -Test Bunte Reihe zur biochemischen Differenzierung Agardiffusionstest

Praktikumsaufgaben II - Neue Aufgaben - Auswertung der MHK – Bestimmung von Penicillin G für einen Stamm von Staphylococcus aureus Bestimmung der MHK mittels E-Test Quantitativer Nachweis von Gentamicin im Serum Mikroskopische Beurteilung typischer bakterieller Meningitis-Erreger

Demonstrationen Kommerzielle Bunte Reihe–Systeme Unbeimpfte und beimpfte API-Systeme beimpfte Phoenix-Panels Optochinempfindlichkeit von Streptococcus pneumoniae Verschiedene Blutkultursysteme

Oxidations - Fermentations –Test - Aufgabe 1 -

Beweglichkeitstest - Aufgabe 1 - Positive Reaktion nach Bebrütung: Schwärmzone im halbfesten Agar (Vorhandensein von Geißeln)

O / F / B – Ergebnisse - Aufgabe 1 - Keimart O F B Pseudomonas aeruginosa + - Escherichia coli Acinetobacter sp.

Auswertung Bunte Reihe - Aufgabe 2- Beachten Sie hierzu die Anmerkungen im Skript aus der 2. Kursstunde (S. 18 ff) Zugabe von Zusatzreagenzien: Tryptonbouillon Voges-Proskauer-Bouillon Kligler-Agar: Hoch-/ Schrägschicht, H2S- und Gasbildung bewerten

Zweizucker-Eisen-Agar nach Kligler 1 = Pseudomonas aeruginosa (Nonfermenter) 2 = Salmonella enteritidis (Fermenter) 3 = Escherichia coli (Fermenter) Bestandteile Laktose, Glukose (10:1) Pepton, Thiosulfat, Fe3+-Citrat Schrägschicht Laktoseverwertung (gelb) Hochschicht Glukoseverwertung (gelb) Gesamt Gasbildung 3H2S + 2Fe3+  Fe2S3 + 6H+ (Eisensulfid; Schwarzfärbung) 1 2 3

Auswertung Bunte Reihe - Aufgabe 2- Stamm Ergebnis 1 Escherichia coli 2 Klebsiella pneumoniae 3 Proteus mirabilis

Auswertung Antibiogramm (Aufgabe 3) Diskutieren Sie die Ergebnisse mit Ihrem Kursassistenten !

Bestimmung der MHK mittels E-Test - Aufgabe 4 - Prinzip: Ein Papierstreifen, der ein Konzentra-tionsgefälle eines Antibiotikums enthält, wird auf eine beimpfte Agarplatte aufgelegt. Die MHK kann nach Inkubation direkt an der Schnittstelle des birnenförmigen Hemmhofes abgelesen werden.

Bestimmung der MHK mittels E-Test - Beispiele I -

Bestimmung der MHK mittels E-Test - Beispiele II - 0,190 mg/l

Bestimmung der MHK mittels E-Test - Aufgabe 4 - Lesen Sie folgende MHK-Werte ab: Streptococcus pyogenes MHK für Penicillin G Müller-Hinton-Agar mit Blut Enterococcus faecalis MHK für Vancomycin Müller-Hinton-Agar ohne Blut

Wachstum und Indikatorumschlag MHK – Bestimmung von Penicillin G für Staphylococcus aureus (Aufgabe 5) (MHK [mg/l] ) Wachstum und Indikatorumschlag (MBK [mg /l] )

Sensibel, mäßig sensibel oder resistent ? Routinetestung im Antibiogramm: verschiedene Antibiotika in definierter Konzentration Vergleich MHK-Bestimmung/Resistogramm: ein Antibiotikum in aufsteigender Konzentration empfind- lich resistent

Bestimmung des Gentamicinspiegels im Serum mittels Bioassay (Aufgabe 6) Gegeben: Gentamicinlösung mit 20µg/ml Benötigt: 3 weitere Verdünnungen (10µg/ml, 1µg/ml, 0,1 µg/ml)

Gentamicinspiegel-Bestimmung II - Verdünnungsreihe - Gentamicin [20 µg/ml] 0,5 ml - NaCl 0,9 % 0,9 ml überpipet-tieren 0,1 ml Gentamicin- Endkonz. 10 µg/ml 1 µg/ml 0,1 µg/ml

Gentamicinspiegel-Bestimmung III Platte und Vertiefungen zuerst beschriften ! Einfüllen der Verdünnungen in die Platten-vertiefungen mit einer Pasteurpipette (randvoll), mit der niedrigsten Konzentration beginnen! Serum mit bekannter Konzentration in die mittlere Vertiefung einfüllen Platten jeweils mit der Agarfläche nach oben stehen lassen!

Falldarstellung Ein 10-jähriges Kind wird stationär in der Kinderklinik aufgenommen. Im Laufe des Tages klagt es über zunehmende Kopfschmerzen und Übelkeit. Es wird zunehmend somnolent, bei Aufnahme ist es nicht mehr ansprechbar. Bei einer Untersuchung zeigt sich eine Nackensteifigkeit. Bei Aufnahme bietet das Kind stark erhöhte Temperaturen von 39,5°C. An welche Erkrankung denken Sie ? Wie ist Ihr diagnostisches Vorgehen ?

Meningitis - Erregerspektrum Neugeborene Streptococcus agalactiae Listeria monocytogenes Escherichia coli K1 Kinder Streptococcus pneumoniae Neisseria meninigitidis Haemophilus influenzae (heute selten) junge Erwachsene Neisseria meningitidis Streptococcus pneumoniae Erwachsene Listeria monocytogenes

Streptococcus pneumoniae Weltweit einer der wichtigsten bakteriellen Infektionserreger Altersgruppen mit höchstem Infektionsrisiko: Kinder: < 5 Jahre Erwachsene: > 60 Jahre Wkly Epidemiol Rec. 1999;74:177-184.

Kapselpolysaccharid von S. pneumoniae

Pneumokokken-Impfstoffe Pneumokokken-Konjugatstoffe ermöglichen den Impfschutz gegen invasive Erkrankungen im Säuglingsalter !

Impfbedingter Rückgang der invasiven Pneumokokkenerkrankungen in den USA Whitney et al. NEJM 2003

Neisseria meningitidis gramnegative Diplokokken nur beim Menschen normaler Bewohner des Nasen-Rachenraumes (10 - 30%) Virulenzfaktoren Polysaccharidkapsel (12 Typen: u.a. A, B, C, W135, Y) IgA-Protease Opc-Protein (Eindringen in die Schleimhaut) Lipopolysaccharide (schwere Symptomatik)

Neisseria meningitidis Wichtigste Komplikation Waterhouse-Friedrichsen-Syndrom (WFS) Verteilung der Kapseltypen gemäßigte Klimate: sporadische Form: überw. Typ B BRD: 2/3 Serogruppe B, 1/4 Serogruppe C USA: 1/3 Serogruppe B, 1/3 Serogruppe C, 1/3 Serogruppe Y tropische Länder: epidemische Form: Typ A und C Polysaccharid des Kapseltyps B aus Polyneuraminsäure kaum Antikörperproduktion, da dieser Zucker auch auf menschlichen Zellen zu finden ist

Neisseria meningitidis Z. Zt. ca. 600 Fälle pro Jahr in Deutschland Ca. 20-30 % durch Serotyp C In England und Wales Rückgang der Serotyp C-Fälle nach Impfprogramm 1999 ff. BRD: MenC-Konjugatimpfung für alle Kdr. >1 J. seit 07 / 2006 als Standardimpfung empfohlen (STIKO) Polysaccharid-Impfstoff (ACW135Y oder A/C) ab vollendetem 2. LJ. (Indikations- /Reiseimpfung)

Anzahl der Todesfälle in Klammern Invasive Meningokokken-Erkrankungen in Deutschland 2001-2006 Erkrankungen und Todesfälle Anzahl der Todesfälle in Klammern Epid. Bull. (2007)32:297-306

Invasive Meningokokken-Erkrankungen in Deutschland 2001-2006 Serogruppen B und C Serogruppe B Serogruppe C Epid. Bull. (2007)32:297-306

Neisseria meningitidis Krankheitsverlauf Typ B versus Typ C (BRD 2006) Allgemein: 70 % Meningitis, 37 % Sepsis (ca. 30 % mit WFS), 6 % mit beiden Diagnosen Sepsis: Typ C > Typ B (43 % vs. 34 %) Letalität: Gesamt: 9,6 % Typ C > Typ B (14 % vs. 8 %) Höhere Letalität für Typ C in allen Altersgruppen, v.a. < 5-Jährige sowie dann wieder mit zunehmendem Alter ab dem Jugendalter (BRD 2001–2006) Epid. Bull. (2007)32:297-306

Haemophilus influenzae gramnegative Stäbchen (pleomorph) Kapseltypen a-f; Wichtigster Kapseltyp: Typ b Kommensale H. influenzae benötigt besondere Wachstumsbedingungen Hämin (Faktor X) NAD (Faktor V) S. aureus 'Amme'

Systemische Haemophilus influenzae Erkrankungen (ESPED 1993-1999 klinisch) Die Einführung der Hib-Konjugatimpfstoffe führte zu einer Reduktion invasiver Hib-Erkrankungen ! Quelle: Schmitt, H.J.: 40th ICAAC Toronto, 2000, Abstract 411 In den Jahren 1996 und 1997 erfolgte keine Erfassung von Hib-Erkrankungen durch die ESPED.

Mikroskopie von Meningitis-Erregern - Aufgabe 7 - Präparate: Neisseria meningitidis (Liquor, Gram) Neisseria meningitidis (Liquor, Methylenblau) Streptococcus pneumoniae (Liquor, Gram) Streptococcus pneumoniae (Tuschepräparat) Haemophilus influenzae (Liquor, Gram) Achten Sie auf die typische Morphologie der Erreger und skizzieren Sie diese ! Beurteilen Sie auch die zelluläre Lagerungsform (intra- und / oder extrazellulär). Tuschepräparat: Negativdarstellung der Kapsel von Streptococcus pneumoniae Angefärbte Zellkörper (Diplokokken)

Streptococcus pneumoniae Grampräparat

Streptococcus pneumoniae

Streptococcus oralis u.a. Streptococcus pneumoniae DEMO: Optochin-Test negativ positiv Streptococcus oralis u.a. Streptococcus pneumoniae Med. Mikrobiologie Ruhr-Universität Bochum

Neisseria meningitidis Grampräparat

Meningitis-Befundkonstellationen

DEMO Blutkulturflaschen BK-Paare aerob / anaerob: unbeimpft vs. beimpft / bewachsen mit / ohne Kohlezusatz PEDS-Flaschen Beachten Sie auch den Indikator-umschlag bewachsener Flaschen am Boden der Flaschen !