Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK Transfektionsmethoden und Transfektionsoptimierung

Transfektionsmethoden Nadja Züfle pädiatrische Onkologie und Hämatologie, CVK Transfektionsmethoden

Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien Definitionen Transfektion Einbringen von Fremd-DNA in Zellen oder Bakterien Transiente Expression Vorübergehende Expression z. B: Verlust bei Zellteilung („Verdünnung“)

Transfektionmethoden Retroviraler Gentransfer (eigentliche Bezeichnung: Transduktion) Lipofektion Elektroporation CaPO4-Transfektion Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)

Methoden: Retroviraler Gentransfer  dauerhafte Expression Transfektionsmethoden Methoden: Retroviraler Gentransfer  dauerhafte Expression Lipofektion  transiente Elektroporation Expression CaPO4-Transfektion Andere (z.B. Mikroinjektion, Genegun)

Retroviraler Lebenyzyklus: Retroviraler Gentransfer Retroviraler Lebenyzyklus: RNA-Strang Infektion & „Enthüllung“ RNA DNA Reverse Transkription Integration

Retroviren und Gentransfer: Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus)

Retroviren und Gentransfer: Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“)

Retroviren und Gentransfer: Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“) Einbringen des Plasmids durch Transfektion

Retroviren und Gentransfer: Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Verpackungszell-Linie (alle Erbinformation für das „leere“ Virus) Plasmid mit dem einzubringenden Gen (= „Virusinhalt“) Einbringen des Plasmids durch Transfektion Virusproduktion

Retroviren und Gentransfer: Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Infektion

Retroviren und Gentransfer: Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Reverse Transkription Infektion

Retroviren und Gentransfer: Retroviraler Gentransfer Retroviren und Gentransfer: Reverse Transkription Infektion Integration

Prinzip der Lipofektion: DNA + liposomales Reagenz Inkubation  Liposomen endozytotische Aufnahme Transient veränderte Zelle

Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension

Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension

Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension Küvette zwischen Elektroden positionieren

Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension Spannung und Kapazität einstellen

Prinzip der Elektroporation: DNA Zellsuspension Puls auslösen

Prinzip der Elektroporation: Zellen Puls auslösen DNA

Prinzip der Elektroporation: Zellen DNA Aufnahme der DNA

Prinzip der CaPO4-Transfektion:

Prinzip der CaPO4-Transfektion:

Prinzip der CaPO4-Transfektion:

Prinzip der CaPO4-Transfektion:

Transfektionsoptimierung Nadja Züfle pädiatrische Hämatologie und Onkologie, CVK Transfektionsoptimierung am Beispiel der CaPO4-Transfektion

Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf Optimierung Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf

Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf Optimierung Ausgangsprotokoll Trono Laboratories, Genf Welche Parameter sind wichtig? Zelldichte DNA-Menge CaPO4-Menge pH-Wert des Puffers Inkubationszeit andere (Temperatur der Reagenzien, Handhabung, Mengenverhältnisse, …)

3. Ansatztabelle Optimierung Nr. Zell-dichte DNA CaPO4 pH Puffer Inkuba-tionszeit Transfektions-effizienz 1 3 * 106 20 µg 250 µl 7,1 35 Min Im FACS auswerten 2 30 µg 3 40 µg

3. Ansatztabelle 4. Plasmid-DNA Optimierung 3. Ansatztabelle Nr. Zell-dichte DNA CaPO4 pH Puffer Inkuba-tionszeit Transfektions-effizienz 1 3 * 106 20 µg 250 µl 7,1 35 Min Im FACS auswerten 2 30 µg 3 40 µg 4. Plasmid-DNA Zur Optimierung ein Plasmid mit Reportergen z.B. GFP  gute Auswertbarkeit im FACS

Optimierung Protokoll – Tag 0 Ausaat 24 h vor der Transfektion Zellen splitten und mit der gewünschten Zelldichte aussäen (z.B. 3*106 Zellen auf einer 10 cm Platte)

Protokoll – Tag 1 Transfektion Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion Zutaten pro Ansatz je ein 10 ml Tube 250 µl steriles Wasser DNA (z.B. 40 µg für 3*106 Zellen) 500 µl HBS 250 µl 0,5 M CaCl2 1 ml Plastikpipette Vortexer (so nah wie möglich an der Sterilbank oder sogar drunter) Alle Reagenzien: Raumtemperatur!

Protokoll – Tag 1 Transfektion Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung DNA (z.B. 40 µg) Mischen durch Pipettieren

Protokoll – Tag 1 Transfektion Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung DNA (z.B. 40 µg) Kräftig vortexen dabei 500 µl 2fach HBS-Lösung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde! Mischen durch Pipettieren

Protokoll – Tag 1 Transfektion Optimierung Protokoll – Tag 1 Transfektion 250 µl steriles Wasser 250 µl CaCl2-Lösung DNA (z.B. 40 µg) Kräftig vortexen dabei 500 µl 2fach HBS-Lösung dazugeben 1 Tropfen pro Sekunde!  dann 35 Min. inkubieren bei RT Mischen durch Pipettieren

Protokoll – Tag 2 Detoxifikation Optimierung Protokoll – Tag 2 Detoxifikation 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen warmes Medium!

Protokoll – Tag 2 Detoxifikation Optimierung Protokoll – Tag 2 Detoxifikation 24 h nach Transfektion Mediumwechsel durchführen warmes Medium! Protokoll – Tag 3 - Auswertung Auswertung der Zellen im FACS Anteil der lebenden Zellpopulation, die das GFP produziert? Anteil der überlebenden Zellen?