Maximal methodisch www.charite.de/maximalmethodisch.

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1 maximal methodisch

2 Durchflusszytometrie (2): DNA-Gehalt- und Zellzyklusmessungen Stephan Lobitz Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie (CVK) +

3 Wofür braucht man das ? Bestimmung des Chromosomensatzes einer (Misch-) Population (Euploidie, Aneuploide, Polyploidie) Veränderungen im Zellzyklus, z.B. - Tumorzellen mit erhöhter Proliferationsrate - DNA-Reparaturerkrankungen, z.B. Fanconi- Anämie mit typischem G2-Arrest

4 Zellzyklus

5 DNA-Färbung: Grundprinzip
Der fluoreszierende Farbstoff Propidiumiodid interkaliert in DNA In einem gewissen Bereich geschieht das stöchiometrisch => Je mehr DNA, desto mehr Fluoreszenz

6 (Ein) Protokoll Man nehme: 70 % Methanol (EISKALT!!!)
RNAse-Stocklösung (1 mg/ml) Propidiumjodid-Stocklösung (1 mg/ml) PBS mit 2 % FKS 1 diploider Standard als Kontrolle

7 (Ein) Protokoll Zellen pelletieren
Unter starkem Vortexen mit eiskaltem Methanol überschichten und 1 Stunde fixieren Zweimal mit PBS/FKS waschen, zählen und 1 Mill. Zellen in ein FACS-Röhrchen geben Erneut pelletieren

8 (Ein) Protokoll Pellet in 425 µl PBS resuspendieren
50 µl RNAse (1 mg/ml) zugeben 30 min bei 37°C im Dunkeln inkubieren 25 µl Propidiumiodid (1 mg/ml) zugeben Messen

9 (Ein) Protokoll Beim Messen beachten: 50.000 events registrieren
Flow-Rate auf low stellen Max. 300 Zellen/Sekunde messen Beachten, dass DDM-Parameter aktiviert sind (dazu später mehr...)

10 Wie war das nochmal mit dem FACSen?

11 Partikel werden mit einem Laser beschossen
Detektor Was steck ich vorne rein? Was kommt hinten raus? Partikeleigenschaften

12 Das gängigste Durchflusszytometer ist der FACSCalibur von BD

13 Der Calibur hat zwei Laser
FL1 Roter Dioden-Laser ~635 nm SSC FL3 FL4 . Blauer Argon-Laser 488 nm FL2 Flow Cell FSC

14 Roter Dioden-Laser ~635 nm
Der Calibur misst: Interne Partikel- komplexität (SSC) FL-1 FL1 Roter Dioden-Laser ~635 nm SSC FL3 FL4 . Blauer Argon-Laser 488 nm FL2 Flow Cell FSC FL-2 FL-4 FL-3 Partikelgröße (FSC)

15 Umwandlung des Lichtsignals in einen Spannungspuls am Detektor
Laser Spannung Zeit Laser Spannung Zeit Laser Spannung Zeit

16 Ein Spannungspuls kann nach 3 Kriterien ausgewertet werden
Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) Volt 40 Zeit (µs) Pulsweite (W) = Dauer

17 Warum ist das SOOO wichtig ????

18 Weil die Software routinemäßig nur die Pulshöhe aufzeichnet
Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) Volt 40 Pulsweite (W) Zeit (µs)

19 Über Pulsweite und Fläche kann man aber Einzelzellen von Aggregaten unterscheiden...
Laser Laser Spannung Spannung Zeit Zeit Laser Spannung Spannung Laser Zeit Zeit Spannung Spannung Laser Laser Zeit Zeit

20 - aber NICHT zwangsweise in der Pulshöhe
... denn Einzelzellen und Dubletten unterscheiden sich in Pulsweite und -fläche Pulsfläche (A) Volt Pulshöhe (H) Zeit (µs) Pulsweite (W) Pulsweite (W) - aber NICHT zwangsweise in der Pulshöhe

21 Die Einzelzellbetrachtung ist bei Zellzyklusmessungen extrem relevant!!!
vs. Faktor Faktor 2

22 Anders gesagt: 2 x G1 macht 1 x G2

23 Die Lösung: Das Feld DDM-Parameter
Zurück zum Problem: Die CellQuest-Software zeichnet routinemäßig nur die Höhe eines Pulses auf Die Lösung: Das Feld DDM-Parameter DDM = doublet discrimination

24 (Four Colour darf dabei nicht gecheckt sein !!)
Es werden alle drei Parameter (Höhe, Weite, Fläche) aufgezeichnet - nicht nur die Höhe !!! (Four Colour darf dabei nicht gecheckt sein !!)

25 Jetzt wird‘s richtig tricky! Gut AUFPASSEN!!!!!
Die THEORIE: G1: 1. Signal deutlich niedriger viel weniger Fläche 2. etwas kleinere Zellen etwas kürzere Dauer Zeit Spannung G2: 1. Signal deutlich höher viel mehr Fläche 2. etwas größere Zellen etwas längere Dauer Spannung Zeit Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal + größere Fläche

26 Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal
Weiter gut AUFPASSEN!!!!! Einzellzellen G2: 1. Signal deutlich höher viel mehr Fläche 2. etwas größere Zellen etwas längere Dauer Spannung FL-3-Fläche Zeit G1: 1. Signal deutlich niedriger viel weniger Fläche 2. etwas kleinere Zellen etwas kürzere Dauer Zeit Spannung FL-3-Weite Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal

27 Der Beweis, dass man die richtigen Zellen ausgewählt hat...
FL3-Höhe FL3-Fläche Linearer Zusammenhang zwischen Fläche und Höhe

28 G1/G0 G2/M Dazwischen: S-Phase
Einzelzell- diskriminierung Der erwähnte lineare Zusammenhang G1/G0 CV als Gütekriterium G2/M Dazwischen: S-Phase Als besonderes Bonbon: Anfärbung der Mitose durch spezif. Anti-Histon-H3-Antikörper

29 Auswertung der Daten I Innerhalb von CellQuest Vorteil: einfach und billig Nachteil: S-Phase wird falsch niedrig bestimmt (vgl. Dean PN, J Cell Biol Feb;60(2):523-7)

30 Auswertung der Daten II: Spezial-Software, z.B. ModFit
G0/G1 G2/M S Wieder die Einzelzell- diskriminierung

31 Ein Beispiel für Aneuploidie

32 Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen
Verwendung anderer Farbstoffe z.B. 7-AAD statt PI (teurer und aufwändiger, aber schmaleres Emissionsspektrum), daher günstiger bei Benutzung weiterer Antikörper Darstellung der S-Phase durch BrdU-Pulsbehandlung

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34 Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen
Anfärbung einer bestimmten Zellzyklusphase durch einen Antikörper (z.B. Mitose durch anti-Histon-H3) Trennung von Tumor- und Normal-population durch tumorspezif. Antikörper (z.B. Zytokeratinantikörper beim Colon-Ca)

35 Weitere Infos und Software-download

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37 Nächstes Thema: Stephanie Krämer, Tierärztin (Nephrologisches Forschungslabor) „Einführung in das tierexperimentelle Arbeiten und gesetzliche Grundlagen“ Bitte haltet euch über die homepage auf dem Laufenden: