PROTEOMICS (2) Vortrag im Rahmen des Genomics/Datenbanken Seminars Von: Tabea Mundinger Betreuer: Benedikt Brors

Gliederung Einleitung Pankreatitis, Pankreaskarzinom Durchführung Analysemethoden 2D PAGE Massenspektrometrie und Identifikation Western Blot Immunohistochemie Ergebnisse Diskussion

Einleitung 2003 Sequenzierung des menschlichen Genoms Warum? Differentielle Genexpression kann in verschiedenen Geweben verglichen werden (microarrays etc.) Liefert nicht immer eindeutige Ergebnisse Warum? Krankheiten beruhen oft auf Proteindefekten, nicht Genexpressionsdefekte  Proteomics als wichtige Methode in z.B. Krebsforschung

Einleitung Anwendung Proteomics in Krebsforschung: Shen et. al., Cancer Research Dez. 2004: Vergleich der Proteinexpressionsprofile von normalem Gewebe, Gewebe befallen von Pankreatitis und Pankreaskarzinomgewebe 2D Polyacrylamide Gel Electrophoresis (2D PAGE) Matrix-Assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF)

Pankreas Wichtigste Verdauungsdrüse im Körper Exokriner Teil: Verdauungssäfte Bicarbonat Carbohydrasen, Esterasen, Proteasen, Nukleasen Endokriner Teil: Hormone Insulin, Glucagon, Somatostatin, Pancreatic Polypetide (PP) Werden in den Langerhansschen Zellen hergestellt Kontrolieren hauptsächlich Glycogenolyse, Glycogenese, Glucoseoxidation

Pankreatitis Entzündnug der Bauchspeicheldrüse Selten, aber gefährlich 15% der Fälle enden tödlich Auslöser (unter Anderem): Stoffwechselstörungen, Alkoholismus, Gallensteine, Durchblutungsstörungen, Infektionen (Mumps, Coxsackie-Virus) Gefährlich weil freiwerdende Verdauungssäfte umliegende Gewebe beschädigen

Pankreasadenokarzinom Entsteht meistens aus exokrinem Teil Selten (1-2% aller Krebsarten) ABER: viert-häufigste Krebstodesursache Späte Erkennung: Anfangs nur leichte Symptome Schwere Symptome (Oberbauchschmerzen, Gelbsucht) später  mehr als ½ der Fälle schon Metastasierung

Analysemethoden (1): 2D PAGE Kombination aus Isoelektrischer Fokusierung (IEF) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 1. Dimension: IEF: Gelstreifen mit immobilisiertem pH Seperation nach Isoelektrischem Punkt 2. Dimension: SDS-Page Seperation nach Molekulargewicht

Analysemethoden (2): MALDI-TOF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Co-Kristallisation von Protein und Matrix Energetische Anregung durch Laserimpuls Explosionsartige Teilchenablösung (Matrix verhindert Fragmentierung der Proteine) Detektor: ToF Misst Flugzeit der Proteine  Massenbestimmung

Analysemethoden (3): Western Blot Elektrophorese Blotting Übertragung auf Nitrozellulose mittels Puffer Hybridisierung Markierung mit Antikörpern (radioaktives oder enzymatisches Label) Nachweis: Farbreaktion, Chemilumineszenz oder Autoradiographie

Analysemethoden (4): Immunohistochemie Primärantikörperfärbung Gegen ein spezifisches (schon bekanntes) Protein Sekundärantikörperfärbung Gegen konstanten Teil des Primärantikörpers Label: enzymatisch, fluoreszierend Hier: biotinyliert Signal wird verstärkt  mehrere Antikörper können binden Nachweis

Durchführung Gewebeproben: 2D PAGE MALDI-TOF 6x Normale Pankreasproben 7x Pankreatitis 6x Pankreaskarzinom 2x normale Gewebeproben von Karzinompatienten 1x Karzinom- und normale Pankreasprobe vom gleichen Patient 2D PAGE MALDI-TOF Datenbanken Suche (MS-Fit 3.2.1) Verifikation Western Blot, Antikörperfärbung (ICH)

Ergebnisse (Beispiel: Galectin-1) 1. Experiment: alle Proben getestet 2. Experiment: 6/8 Normal 5/7 Pankreatitis 4/6 Krebs Gewebe 29 Proteine wurden identifiziert Antioxidanten, Chaperone (oder Chaperon-ähnliche Proteine), Calcium-abhängige Bindeproteine, Proteasen, Verdauungsenzyme, Signaltransduktionsproteine, ECM Proteine

Galectin-1 Schon durch mRNA Experimente mit Pankreas Karzinom in Verbindung gebracht Zell-Adhesion Reguliert Zellwachstum Inhibiert Apoptose

Ergebnis (Galectin-1) 2D PAGE MALDI-TOF 6x höhere Expression im Krebsgewebe

Validierung (Galectin-1) Western Blot 4/6 Krebsgeweben 0/8 normalem Gewebe 0/7 Pankreatitis

Validierung (Galectin-1) ICH 67% der Krebsgewebeproben (D) enthalten galectin-1 100% des Stromas (E) enthält galectin-1 Kein galectin-1 in normalem Gewebe (F)

Diskussion Bestätigung von früheren Ergebnissen Aber: Mehr als 30 von 40 untersuchten Proteinen konnten durch neue Methoden erstmals mit Pankreaskarzinom in Verbindung gebracht werden

Vielen Dank!!! Quellen: Shen et al., Protein Expression Profiles in Pancreatic Adenocarcinoma Compared with Normal Pancreatic Tissue and Tissue Affected by Pancreatitis as Detected by Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Mass Spectrometry, CANCER RESEARCH 64, 9018–9026, December 2004 Iacobuzio-Donahue et al. Highly expressed genes in pancreatic ductal adenocarcinomas: a comprehensive characterization and comparison of the transcription profiles obtained from three major technologies. Cancer Res 2003;63:8614 –22 Person et al. Comparative identification of prostanoid inducible proteins by LC-ESI-MS/MS and MALDI-TOF mass spectrometry. Chem Res Toxicol 2003;16:757–7 http://www.m-ww.de/krankheiten/innere_krankheiten/pankreatitis.html http://www.m-ww.de/krankheiten/krebs/pankreaskarzinom.html http://de.wikipedia.org/wiki/2D-Gelelektrophorese http://www.lexikon-glossar.de/Antikoerperfaerbung.html http://www.unics.uni-hannover.de/analytik/GrundlagenAnalytik/Analytik%202/Makromo/Maldi%20TOF.html http://msfit.biochem.okstate.edu/ucsfhtml3.2/msfit.htm http://de.wikipedia.org/wiki/MALDI http://de.wikipedia.org/wiki/Time-of-flight_Massenspektrometer