- MicroRNA - Vorhersagen menschlicher Zielgene Präsentation von Sophia Bardehle Seminar Genomics, Juni 2005 betreut durch Herrn Dr. Benedikt Brors, DKFZ

Funktion von Zielgenen Inhalt Bedeutung der miRNA „TargetScan“ Target - Vorhersagen Nachweis im Experiment Funktion von Zielgenen News - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Bedeutung der miRNA endogene, ~22-nt, nicht-codierende RNA in Pflanzen und Tierzellen Funktionen:  molekulare Mechanismen unklar  bis 2003 miRNA Targets in Vertebraten unbekannt Zuerst in c.elegans erfporscht; auch in pfl. viel bekannt (vor allem entwicklungssteuernd) Funktionen: posttranskriptionale Restriktion (z.B. HOX) gene silencing mRNA Abbau (nur in Pflanzen) associated with a ribonuclease complex (RNA interference specif icity complex, or RISC) (http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna_exp.html) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

= konservierte 5‘ Region miRNA : Target 3‘ UTR Sequenz der mRNA nach Quelle 1) „miRNA seed“ = konservierte 5‘ Region Eine UTR zT mehrere Bindestellen für gleiche miRNA oder verschiedene miRNAs Bei Pflanzen bindet miRNA zT außerhalb 3‘ UTR MRE= miRNA recognition element keine perfekte W-C- Komplementarität - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“ Algorithmus zur Vorhersage von Zielgenen für konservierte miRNA in Wirbeltieren Prinzip: Identifizierung der mRNA, die konservierte Bindung mit „miRNA seed“ eingeht. - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Methode Grundlage: konservierte miRNA mehrerer Organismen (Rfam Download; Sanger Institute) Annotationen orthologer 3‘UTR mRNA-Sequenzen (Ensembl  EnsMart) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Methode Suche nach „seed-match“,d.h. perfekte W-C-Paarung einer Heptamersequenz zwischen 3‘ UTR und 5‘ „miRNA seed“ „RNAfold“ liefert optimale Basenpaarung für 3‘ Ende der miRNA nach Quelle 1) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Methode Berechnung der freien Energien G der miRNA : Target Interaktionen G1 G2 nach Quelle 1) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Methode 4) jede UTR erhält Z-Score erwähnen, dass T= Gewichtungefaktor N ist Anzahl der miRNA Bindestellen nach Quelle 1) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Methode 5) Sortierung der Z-Scores der UTRs  Rangfolge (Rank R) Untersuchung von Mensch, Maus, Ratte, Fugu Optimal: hoher Rang (großer Z) nach Quelle 1) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Methode 6) Targetvorhersage Kriterien: - hoher Z-Score mit Z ≥ Zc - Rank R ≤ Schwellenwert Rc Parameter: Zc, Rc und T sind frei wählbar T = Gewichtungsfaktor für Affinität der Basenpaarung Erfahrungswerte: (Analyse von Maus, Ratte, Mensch) T= 20 Zc= 4,5 Rc= 200 - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Ergebnisse Analyse von miRNA : Target Interaktionen 14.539 16.370 15.590 451 Limitierung auf konservierte, high-scoring > 400 verschiedene Zielgene nach Quelle 1) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Ergebnisse Ø 3,9 Targets pro miRNA (Klasse: Mammalia) signal noise („false positive“) signal:noise Verhältnis von 3.5 Kurze Erklärung: signal= Gesamtergebnis durch Targetscan noise= falsch positiv (miRNA Kontrolle(zufällig vertauschte Sequenzen mit <15% Abweichung zum Original) liefert Wahrheit; Test an UTR Bindung) nach Quelle 1) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Ergebnisse Bedeutung der Bindung an die 5‘ Region der miRNA nach Quelle 1) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

„TargetScan“- Probleme unvollständige Annotationen für orthologe UTRs reale Targets fallen durch Z-Sore/Rank-Kriterium Bindestellen außerhalb 3‘ UTR unbeachtet nur konservierte Gene in Betracht gezogen gleichzeitige Interaktionen verschiedener miRNAs an einer UTR ausgeschlossen Fazit:  reale Anzahl an Zielgenen pro miRNA ist viel größer - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Experimenteller Nachweis Methode - Luciferase Assay - Auswahl von 3‘ UTR menschlicher Zielgene  PCR Klonierung in Luciferase Vektor PCR  Selektion nach Insert: Wildtyp oder Mutante Transformation des Luciferase Reporter Plasmids in menschliche HeLa-Zellen Messung der Luciferase Aktivität (Lumineszenz) Photinus pyralis Luciferase katalysiert Oxidation von Luciferin (Leuchtstoff). Frei werdende Energie—> Biolumineszenz (grün-gelbliches Licht) Klonierung erfolgt downstream des Luciferase ORF; Durch PCR z.T. Punktmutationen in miRNA Bindestellen (Mutante) HeLa Zellen exprimieren endogene miRNA - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Experimenteller Nachweis Luciferase Reporter Vector Selektion der Vektoren in Wildtyp und Mutante nach PCR nach Quelle 1) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Experimenteller Nachweis Interpretation Wildtype: miRNA : Target site Bindung  Luciferaseexpression ↓  geringe Lumineszenz Mutante: lückenhafte miRNA : Target Basenpaarung  Luciferaseexpression ↑  hohe Signale Luciferase Da Luciferase upstream des eingebauten UTR Fragments liegt, wird durch Bindung einer miRNA auch deren Expression unterdrückt. - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Experimenteller Nachweis Luciferaseaktivität Blau: WT (Normalisierung mittels Renillaaktivität (Lumineszenz)) Rot: Mutante reporter Bewertung: Vgl.mit Expression bekannter Targets aus c.elegans (lin41/let 7 miRNA) >2,1 SMAD-1: DPP Family FUNCTION: Transcriptional modulator activated by BMP (bone morphogenetic proteins) type 1 receptor kinase. SMAD1 is a receptor-regulated SMAD (R-SMAD). (uniProt) N-MYC- protooncogen; nuclearer TF HOX-A5: Musterbildung FUNCTION: Sequence-specific transcription factor which is part of a developmental regulatory system that provides cells with specific positional identities on the anterior-posterior axis. Also binds to its own promoter. Binds specifically to the motif 5'-CYYNATTA[TG]Y-3'. nach Quelle 1) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Experimenteller Nachweis Ergebnis: 15 vermutliche Zielgene („TargetScan“) getestet 11 Gene experimentell bestätigt ca. 30 % der Vorhersagen sind „false positive“ - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Funktionen von Zielgenen große funktionelle Diversität Beispiele TF: High-mobility-Proteine Signaltransduktion: STAT3 Rezeptor: LDL-R Strukturproteine: Collagen Enzyme: G6PD Translationsregulator:COP9 > 400 Zielgene konserviert zwischen Maus, Ratte Mensch COP9: Component of the COP9 signalosome complex (CSN), a complex involved in various cellular and developmental processes. The CSN complex is an essential regulator of the ubiquitin (Ubl) conjugation pathway (uniprot) G6PD: pentose pathway (nucleinsäure synthese) - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Funktion von Zielgenen GO ID Biological Process miRNAs all orthologous genes   no assignment/unknown 130 (32%) 5737 (40%) known biological process 270 (68%) 8802 (60%) GO:0007275 development 52 (13%) 1192 (8%) GO:0019538 protein metabolism 60 (15%) 1788 (12%) GO:0008151 cell growth and/or maintenance 92 (23%) 2742 (19%) GO:0006810 transport 44 (11%) 1442 (10%) GO:0008283 cell proliferation 23 (6%) 764 (5%) GO:0007154 cell communication 76 (19%) 2704 (19%) GO:0007165 signal transduction 61 (15%) 2217 (15%) GO:0006793 phosphorus metabolism 30 (8%) 589 (4%) GO:0009605 response to external stimulus 28 (7%) 1065 (7%) GO:0045449 regulation of transcription 82 (21%) 1210 (8%) GO:0006350 transcription 84 (21%) 1310 (9%) Großer Unterschied in biolog. Funktion zu pflanzl. miRNA: 69% TF; fast alle TFs steuern Pfl.entwicklung ( Säuger: nur 13%) Achtung: miRNAs steuern mehrere Gene (mit unterschiedl. Funktionen), d.h. können in mehereren GO Einträgen zugeordnet sein keine Aussage aus Summe der Prozentangabe# Letzete spalte: initial set of orthologous genes homo-mouse-rat - miRNA Targets - Sophia Bardehle

News TargetScanS 2005 5-Genome-Analyse (signal:noise ↑)  Identifizierung von 5300 meschlichen Genen, die durch miRNA reguliert werden (~30% des Genoms) TargetScan Webserver Datenbank zur Suche nach konserv. miRNA Targets bzw. Zielgenen  http://genes.mit.edu/targetscan/ TSS: homo, maus,rn, dog, huhn 6nt match flankierende Adenosine (5‘ an UTR) „S“ = Simplify - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Cambridge, Massachusetts Cambridge, Massachusetts Referenzen Burge Lab MIT Departm. of Biology Cambridge, Massachusetts Bartel Lab Whitehead Institute Cambridge, Massachusetts 1) Prediction of Mammalian MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,3, I-hung Shih2,3, Matthew W Jones-Rhoades1,2, David P Bartel1,2, Christopher B Burge1. Cell, Vol. 115 (7), December 26, 2003. 2) Conserved Seed Pairing, Often Flanked by Adenosines, Indicates that Thousands of Human Genes are MicroRNA Targets Benjamin P Lewis1,2, Christopher B Burge1, David P Bartel1,2. Cell, Vol. 120 (1), January 14, 2005. (1) Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA (2) Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA -> artel+Lewis - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Referenzen Bartel Lab: http://web.mit.edu/biology/www/facultyareas/facresearch/bartel.shtml Burge Lab: http://genes.mit.edu/burgelab/ I-hung_Shih-original-presentation.pdf David Baulcombe (2002) "An RNA Microcosm", Science, 297: 2002-2003) Ambion: http://www.ambion.com/techlib/resources/miRNA/mirna_exp.html Marianthi Kiriakidou, Peter T. Nelson et al. “A combined computational-experimental approach predicts human microRNA targets” - miRNA Targets - Sophia Bardehle

Eingabe: LDLR Ausgabe: 2 verschiede miRNAs Auswahl Details: mi-130a