Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien Institut für Biochemie Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften Technische Universität Dresden Klinik und Poliklinik für Urologie Universitätsklinikum Carl Gustav Carus Technische Universität Dresden Untersuchungen zur Funktion des P38IP-Gens bei Prostatazelllinien Doreen Kunze 21.07.05

Prostatakarzinom (PCa) Einleitung 2 Prostatakarzinom (PCa) häufigste Krebserkrankung bei Männern zweithäufigste Krebs-Todesursache Lebenszeitrisiko: zu erkranken: 9,6 % zu sterben: 3,2 % Häufigkeitsgipfel zwischen 70. – 75. Lebensjahr genetisch und tumorbiologisch sehr heterogen

Einleitung 3 Tumorentwicklung Überexpression von Onkogenen und/oder funktionelle Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen (TSG) PCa: Onkogene: Progression TSG: Entstehung → häufig Allelverluste (LOH – loss of heterozygosity) auf den Chromosomen- abschnitten 8p und 13q

P38IP (C13orf19, FAM48A) lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei TSG Einleitung 4 P38IP (C13orf19, FAM48A) Chromosom 13 13 RB1 C 13 BRCA2 lokalisiert auf 13q13 zwischen zwei TSG LOH-Ereignisse mRNA-Expression in primären PCa reduziert Hypothese: Tumorsuppressorfunktion in Prostatagewebe → verbesserte Proliferation der PCa-Zellen nach Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression ?

siRNA (small interfering RNA) Einleitung 5 siRNA (small interfering RNA) Zellkern Target-mRNA Target-Gen polyA Sequenzspezifisches Gensilencing Target-mRNA- Spaltung Aktivierter RISC ATP ADP + Pi zelluläre Kinase RISC Bildung von RISC siRNA-Entwindung Anlagerung von RISC an Target-mRNA siRNA Bestandteil der RNA- Interferenz posttranskriptionelle Geninhibierung 2 nt-3`-Überhänge antisense-Strang aktiviert RISC (RNA induced silencing complex) Hydrolyse komplementärer mRNA modifiziert nach D. Bauer

Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK ? Ziele 6 Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene ? Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK ? Androgenabhängigkeit der P38IP-mRNA-Expression ?

Zeitabhängige Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression in PC-3-Zellen: 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition 7 Aussaat (PC-3, BPH-1) siRNA-Transfektion (125 + 250 nM, 4 h) 24 – 72 h WST-1-Test   Zellzählung RNA-Isolierung + qPCR Apoptosemessung Zellzyklustest Zellkoloniebildungstest 20 – 68 h Zeitabhängige Inhibierung der P38IP-mRNA-Expression in PC-3-Zellen: h nach TF-Start siRNA-D1 (2245-2265 nt) siRNA-D2 (2215-2235 nt) siRNA-D3 (1024-1044 nt) siRNA-D4 (440-460 nt) siRNA-D5 (1288-1308 nt) 12 42 % 49 % 22 % 55 % 12 % 24 50 % 58 % 40 % 56 % 16 % 48 45 % 32 % 67 % 23 % 72 36 % 93 % 31 % P38IP-mRNA-Expression/PBGD, normiert auf ns-siRNA; Klammerausdruck: Position des sense-Stranges der siRNA auf der P38IP-mRNA (3077 nt) effektive, langanhaltende Inhibition der P38IP-mRNA-Expression

→ keine Kurzzeit- proliferations- veränderungen → keine Langzeit- 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition 8 WST-1-Test → keine Kurzzeit- proliferations- veränderungen Zellkoloniebildungstest → keine Langzeit- proliferations- effekte

Apoptosemessung (FACS) - 48 h 1.1 P38IP-mRNA-Inhibition 9 Zellzyklusverteilung → keine Zellzyklus- veränderungen unbehandelt siRNA-D5 5,5 % ns-siRNA 4,9 % 4,3 % Apoptosemessung (FACS) - 48 h → keine Veränderung der Apoptoserate

1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA und CT 10 CT (Etoposid, Docetaxel; 24 h) Aussaat (PC-3) siRNA-Transfektion (250 nM, 4 h) 24 – 72 h 20 h WST-1-Test   Zellzählung Apoptosemessung Zellzyklustest Zellzahlreduktion infolge CT-Behandlung keine Kombinations- effekte keine Apoptoseinduktion

1.2 Kombinationsbehandlung mit siRNA und CT 11 Zellzyklusverteilung CT-vermittelter Zellzyklusarrest Vergrößerung der Zellen infolge des G2/M-Arrestes 125fache Vergrößerung A: PC-3 siRNA-D5 B: PC-3 siRNA-D5 + Etoposid

Zusammenfassung 1.Teil 12 Auswirkungen der P38IP-mRNA-Inhibition auf molekularer und zellulärer Ebene  effektive und langanhaltende Geninhibition durch siRNA P38IP hat keinen Einfluss auf das Wachstum der untersuchten Prostatazelllinien verminderte Expression nicht ursächlich mit PCa-Entstehung verbunden möglicherweise mit Progression der Karzinome assoziiert oder Begleiterscheinung der zunehmenden genetischen Instabilität auf dem Chromosom 13q

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK 13 P38IP = p38MAPK interacting protein MAPK = mitogenaktivierte Proteinkinase intrazelluläre Signalübertragung (Proteinkinasen-Kaskaden) stressaktiviert 4 Isoformen (α, β, γ, δ) SB203580 inhibiert p38α und p38β durch Bindung an ATP-Bindestelle Quelle: www.cellsignalingtechnology.com

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK 14 Inhibition der P38IP- mRNA-Expression mit siRNA-D5 Expression und Phosphorylierungsstatus der p38MAPK Inhibition der p38MAPK durch SB203580 P38IP-mRNA-Expression

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK 15 1. Inhibition von P38IP mit siRNA-D5 phospho-p38MAPK β-Actin p38MAPK (gesamt) siRNA-D5 unbehandelt ns-siRNA Marker PC-3 Erntezeitpunkt nach Transfektion: 72 h 96 h Expression & Phosphorylierungsstatus der p38MAPK unverändert

2. Zusammenhang P38IP – p38MAPK (Ergebnisse) 16 2. Inhibition der p38MAPK mit SB203580 kein Zusammenhang zw. P38IP und p38MAPK

3. Androgenabhängigkeit 17 Aussaat (LNCaP) Hormonfreies Medium 24 h 3 – 48 h Androgen R1881 (+ Bicalutamid) RNA-Isolierung + qPCR P38IP-mRNA-Expression ist nicht androgenabhängig

Kein Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK Zusammenfassung 18 P38IP besitzt keine Tumorsuppressor-funktion in den untersuchten Zelllinien Kein Zusammenhang zwischen P38IP und p38MAPK → Genbezeichnung: C13orf19 oder FAM48A 3. P38IP-mRNA-Expression ist androgen-unabhängig

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit !

Chemotherapeutika Etoposid: Glykosidderivat des Podophyllotoxins (amerikan. Maiapfel) Docetaxel: Taxoid (europ. Eibe – Taxus baccata)

Androgenabhängigkeit R1881 (Methyltrienolon) Bicalutamid Dihydrotestosteron

LOH-PCR

Epitheliale Expression In situ Hybridisierung von Prostatagewebe mit P38IP-mRNA (Schmidt et al. 2001)

Konzentrationsabhängigkeit