verschiedenen urologischen Tumoren Serumkonzentration und intratumorale Verteilung von hTF in Patienten mit verschiedenen urologischen Tumoren Yvonne Förster1, Axel Meye2, Sybille Albrecht3, Matthias Kotzsch3, Susanne Füssel2, Manfred P. Wirth2 und Bernd Schwenzer1 Institut für Biochemie TU Dresden 1 Institut für Biochemie, 2 Klinik für Urologie, 3 Institut für Pathologie, Technische Universität Dresden, Dresden , Germany Zusammenfassung Tissue factor (TF) ist ein transmembranes Glykoprotein, welches in Angiogenese und Metastasierung von Tumoren involviert ist. Über die Verteilung von TF in urologischen Tumoren ist bisher wenig bekannt. In dieser Studie wurde deshalb die TF-Expression in Tumorgewebe und nichtmalignen Gewebe des selben Organs sowie im Serum von Patienten mit Blasenkarzinomen, Prostatakarzinomen und RCC untersucht. Mittels ELISA wurde die Verteilung von TF in Proben von 18 Patienten mit RCC, 7 Patienten mit Blasenkarzinomen und 6 Patienten mit PCa. Bei Patienten mit RCC konnte in 17 von 18 Fällen (94 %) in nichtmalignen Gewebe eine höhere TF Expression detektiert werden als im zugehörigen Tumorgewebe. Für die Patienten mit RCC wurde zusätzlich die relative TF mRNA-Expression bestimmt. In 78 % der Fälle konnte ebenfalls ein höherer Gehalt an TF mRNA im nichtmalignen Gewebe im Vergleich zum Tumorgewebe bestimmt werden. Zusätzlich wurde der TF-Proteingehalt in Serumproben von 66 Patienten mit Blasenkarzinomen, 75 Patienten mit RCC, 157 Patienten mit PCa und 92 Normalpatienten untersucht. Während bei Patienten mit RCC und PCa im Vergleich zu Normalpatienten keine Unterschiede festzustellen waren, wurden bei Patienten mit Blasenkarzinomen signifikant erhöhte TF-Serumwerte (p < 0,01) detektiert. Unsere Resultate zeigen, dass TF in nichtmalignem Gewebe von Patienten mit RCC höher exprimiert wird bei der de novo Expression im entsprechenden Tumorgewebe. Das lässt auf eine tumor-assoziierte Induktion der TF-Expression in den ursprünglich TF-negativen RCC-Vorläuferzellen schließen. Die erhöhten TF-Serumwerte bei Patienten mit Blasenkarzinomen korrelieren mit bereits veröffentlichten Untersuchungen zu TF-Werte im Urin [1]. Die klinische Relevanz dieser Ergebnisse soll in weiteren Untersuchungen aufgeklärt werden. Einleitung TF ist der physiologische Initiator der Blutgerinnung [2], aber auch in Angiogenese und Metastasierung von Tumoren involviert [3,4]. Es konnte von verschiedenen Gruppen gezeigt werden, dass TF in Tumorzellen erhöht exprimiert wird und dass die Expression mit dem Grad der Malignität bzw. der Angiogenese korreliert. Für urologische Tumoren gibt es bisher nur wenige Studien. Für PCa wurde immunhistochemisch gezeigt, dass TF in den meisten Fällen überexprimiert wurde und der TF-Gehalt signifikant mit der Prognose bei PCa-Patienten korreliert [5]. Urinärer TF wurde bei Patienten mit Blasenkarzinomen und PCa bestimmt. Beim Blasenkarzinom konnte ein signifikanter Unterschied zwischen entzündlichen und malignen Erkrankungen festgestellt werden. Da bisher wenig bekannt ist über die Verteilung von TF in malignen Gewebe und zugehörigem nichtmalignen Gewebe des gleichen Organs wurden in dieser Studie Proben von Patienten mit Blasenkarzinomen, PCa und RCC untersucht sowohl auf ihren TF-Proteingehalt als auch auf mRNA-Gehalt untersucht. Weiterhin wurde TF im Serum von Patienten mit urologischen Tumoren und Normalpatienten bestimmt. Material und Methoden Alle Gewebe- und Serumproben stammen von Patienten der Klinik für Urologie der TU Dresden. Tumorstadien für RCC-Patienten wurden nach Thoenes et al. bestimmt. Die Gewebeproben wurde intraoperativ erhalten und in flüssigen Stickstoff aufbewahrt. Tumorgewebe von Patienten mit PCa und Blasenkarzinomen wurden nur analysiert, wenn wenigstens 60 % der Ephitelzellen histopathologisch als Tumorzellen identifiziert wurden. Seren wurden aus Blutproben der Patienten einen Tag vor der Operation gewonnen. TF-Protein wurde mittels ELISA bestimmt [6], TF mRNA wurde mittels LightCycler-Technologie quantifiziert. Ergebnisse In Abb. 1 sind die ermittelten TF-Werte für Proben aus Tumorgewebe und zugehörigem nichtmalignen Gewebe zusammengefasst. Für die Proben aus RCC-Geweben konnte ein signifikanter Unterschied (p = 0,006) zwischen malignen und nicht-malignen Gewebe detektiert werden. In 17 von 18 Proben (94 %) ist der TF-Proteingehalt im nichtmalignen Gewebe höher als im malignen Gewebe (Tabelle 1). Diesen Trend findet man auch bei der TF mRNA. Bei 78 % der Proben ist die TF mRNA im nichtmalignen Gewebe niedriger als im malignen Gewebe. Vergleicht man die Tendenzen von Protein und mRNA, findet man in 13 Fällen erhöhte Protein- und mRNA-Werte für nichtmalignes Gewebe. Histologische Daten Relativer TF-Proteingehalt Relative TF mRNA Menge Patient Tumor stage1 TG Verhältnis TF-Protein (Tf/Tu) ELISA Score Verhältnis TF mRNA (Tf/Tu) mRNA Score (Tf/Tu) RCC2 PT1 G2 15.1 ++ 20.4 RCC6 PT2 G1 43.0 6.8 RCC7 19.8 23.0 RCC9 PT3a 15.3 11.3 RCC11 7.5 9.0 RCC13 39.8 RCC14 10.5 11.4 RCC15 PT3b 5.4 181.9 RCC4 pT2 G3 1.8 + 33.9 RCC16 2.7 9.3 RCC10 6.3 RCC17 5.7 1.4 RCC1 pT3 1.6 3.8 RCC8 7.4 0.2 - RCC18 pT1 6.2 RCC3 1.3 RCC5 2.2 0.3 RCC12 0.7 2.5 Tabelle 1: Vergleich von TF Protein und TF mRNA in malignen und nichtmalignen Nierengewebe. Verhältnisse größer als 1 zeigen höhere TF-Gehalte im nichtmalignen Gewebe als im Tumorgewebe an. Das Verhältnis tumorfrei (Tf) und malignes (Tu) Gewebe wurde für jeden Patienten berechnet (- kein deutlicher Unterschied; + 30 -500 % höhere Expression im nichtmalignen Gewebe versus Tumorgwebe; ++ >500 % Differenz) Alle RCC Patienten zeigten vor der Operation keine Anzeichen für Metastasen (cM0). Alle 18 Fälle waren pN0. Abb. 1: TF-Konzentration in Tumorgewebe und nichtmalignen Gewebe. TF wurde aus Gewebe von 18 Nierenkarzinomen, 7 Blasenkarzinomen und 6 Prostatakarzinomen extrahiert. Signifikante Unterschiede (p = 0,006) in der Expression wurden zwischen Tumorgewebe und nichtmalignen Gewebe von Nieren detektiert. Zusätzlich wurde die TF mRNA und Proteinverteilung in Proben untersucht, die vom Tumor, von der Übergangszone zwischen Tumor und Parenchym und von nichtmalignen Gewebe stammen (Abb. 2). Sowohl TF mRNA als auch Protein sind im nichtmalignen Gewebe höher als im malignen. Die Werte für die Übergangszone liegen zwischen beiden Werten. Neben den Bestimmungen von TF im Gewebe wurde TF auch im Serum von Patienten mit RCC, PCa und Blasenkarzinomen im Vergleich zu Normalpatienten bestimmt (Abb. 3). Statistisch signifikante Unterschiede (p < 0,01)in der TF-Expression bestehen zwischen den TF-Werten von Normalpatienten (0,18 ± 0,15 ng/ml) und von Patienten mit Blasenkarzinomen (0,34 ± 0,5 ng/ml), jedoch nicht bei Patienten mit PCa oder RCC. Abb. 3: TF Protein im Serum von Normalpatienten, Patienten mit RCC, Blasenkarzinomen und PCa. TF Konzentration im Serum von Blasenkarzinompatienten ist signifikant erhöht gegenüber Normalpatienten (p = 0,0076). Diskussion Die hier vorgestellten Ergebnisse erlauben erstmals eine vergleichende Betrachtung der TF-Expression in urologischen Tumoren. In unserer Studie wurde TF in Tumorgewebe von Patienten mit RCC bestimmt. Histogenetisch stammen die Zellen dieses Tumortypes von proximalen Tubuli, welche in normalem Zustand kein TF exprimieren. Wir konnten sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene zeigen, dass auch bei diesem Tumortyp eine de novo Expression von TF stattfindet. Etwa drei Viertel der Proben zeigen nachweisbare, wenn auch im Vergleich zu nichtmalignen Gewebe geringere Mengen TF mRNA. TF-Konzentrationen wurden bereits in verschiedenen biologischen Untersuchungsmaterialien bestimmt. Dabei konnten u.a. für Patienten mit Blasenkarzinomen erhöhte TF-Werte im Urin detektiert werden. Wir konnten zeigen, dass auch die TF-Konzentration im Serum von Patienten mit Blasenkarzinom signifikant erhöht ist. Da die TF-Expression eng mit Wachstum und Verbreitung von Tumoren assoziiert ist,sollten die vorgestellten Ergebnisse Ausgangspunkt für weitergehende Untersuchungen sein, um eine mögliche diagnostische Bedeutung von TF als Tumormarker bewerten zu können. Abb. 2: Vergleich der TF-Werte von Nierenproben in Abhängigkeit der Entfernung von der Tumorperipherie (a) TF Proteinkonzentration in ng/mg Gesamtprotein der Patienten I-IV (b) TF mRNA/b-Actin mRNA der Patienten I-IV. Literatur [1] B.A. Lwaleed, J.L. Francis, M. Chisholm, Urinary tissue factor levels in patients with bladder and prostate cancer. Eur. J. Surg. Oncol. 26 (2000) 44-49. [2] B. Osterud, Tissue factor: a complex biological role. Thromb. Haemost. 78 (1997) 755-758. [3] M.E. Bromberg, R. Sundaram, R.J. Homer, A. Garen, W.H. Konigsberg, Role of tissue factor in metastasis: functions of the cytoplasmic and extracellular domains of the molecule. Thromb. Haemost. 82 (1999) 88-92. [4] J. Folkman, Tumor angiogenesis and tissue factor. Nat. Med. 2 (1996) 167-168. [5] S.A. Abdulkadir, G.F. Carvalhal, Z. Kaleem, W. Kisiel, P.A. Humphrey, W.J. Catalona, J. Milbrandt, Tissue factor expression and angiogenesis in human prostate carcinoma. Hum. Pathol. 31 (2000) 443-447. [6] S. Albrecht, T. Luther, H. Grossmann, C. Flossel, M. Kotzsch, M. Muller, An ELISA for tissue factor using monoclonal antibodies. Blood Coagul. Fibrinolysis 3 (1992) 263-270. Danksagung Wir danken R. Kranz, J. Herrmann und . Bergmann für die technische Unterstützung. Für die ersten Ergebnisse gilt unser Dank A. Probst (Universität Halle-Wittenberg). Die Studie wurde unterstütz durch die Deutsche Krebshilfe e.V. (10-1752).