Molekularbiologische Aspekte beim Prostatakarzinom (PCa) - Grundlagen der Entstehung sowie Möglichkeiten der Diagnostik und Therapie Dr. U. Fiedler Urologisches Forschungslabor Klinik und Poliklinik für Urologie Direktor Prof. Dr. M. Wirth TU-Dresden 1

Histologie des Prostatakarzinoms

Regulation des Prostatawachstums Androgene Wachstumsfaktoren stromal-epitheliale Interaktion

Genexpression in der Prostata Testosteron (T) Dihydrotesto- steron (DHT) DHT T AR 5-a Re- duktase HRE RE Gen ZK Promotor EGF, KGF TGF-b + - Epithelzelle

Veränderungen der Prostata Unkontrolliertes Wachstum von Prostata- zellen meist erst ab dem 50. Lebensjahr Benigne Hyperplasie (BPH) Prostatakarzinom (PCa)

Inzidenz des PCa häufigste Tumorerkrankung beim Mann in der westlichen Welt ca. 250.000 Neuerkrankungen p.a. steigende Inzidenz mit dem Alter insignifikantes PCa bei ca. 20-30% aller Männer über 50

PCa - Tumorstadien Stadium 5-Jahres- Überlebensrate lokal begrenzt 99,1% (T1/T2) lokal fortgeschritten 93,6 % (T3/T4) metastasierend 30,7% (N1, M1)

der Entstehung eines PCa Molekulare Ursachen der Entstehung eines PCa Grundlagen familiäre/hereditäre Ursachen chromosomale Veränderungen (Deletionen, Translokationen, Mutationen) Methylierung Differentielle Genexpression

Familiäres Prostatakarzinom Grundlagen Familiäres Prostatakarzinom unter 65 Jahren: 5-10% familiär bedingt unter 65 Jahren, mind. 4 Betroffene pro Familie: 25-30 % familiäre Ursache prostate cancer susceptibility loci 1q 24-25 (HPC-1) 1p 36 (PCa, Hirntumoren)

Chromosomale Verluste beim PCa (CGH, LOH) Grundlagen 16q E-Cadherin 5q a--Catenin 13q RB, BRCA2 10q PTEN % Verlust Chromosomale Region

Methylierung beim PCa CpG GST-1/AR Grundlagen Inaktivierung von Genen durch Methylierung von CpG-reichen Sequenzen im Promotor CpG GST-1/AR 5‘ regulatorische Sequenz Zielgen Gluthathion S-Transferase (GST-1) Androgenrezeptor (AR)

Onkogene und Tumorsup-pressorgene beim PCa Grundlagen Onkogene ras c-myc c-erb-2 bcl-2 Tumorsuppressorgene p53 Retinoblastom-Gen BRCA2 KAI1

Differtielle Genexpression Grundlagen Methode: DD-PCR (Differential Display PCR) Amplifizerung von cDNA-Fragmenten des Tumor- und tumorfreien Gewebes Tumorfrei Tumor TAAA GAAA mRNA CAAA GTTT cDNA CAAA PCR

Isolierung des putativen Tumorsuppressorgens C13 Grundlagen Chromosom 13q13 Lokalisierung zwischen den Tumor- suppressorgenen BRCA2 und Rb-1 Kernlokalisierungssignal Ähnlichkeit zu Transkriptionsfaktoren epithelspezifische Expression Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

Verlust der Heterozygotie Untersuchungen zum Verlust der Heterozygotie Grundlagen Methode: Untersuchung von Allelverlusten mit Mikrosatellitenmarkern bei Tumor- und tumorfreiem Gewebe Allel 1 ACACAC Allel 2 ACACACAC PCR tumorfrei Tumor

C13-LOH-Analysen im Bereich 13q13 LOH oder AI: 61 % Grundlagen 5 Mikrosatellitenmarker im Bereich 13q13 LOH oder AI: 61 % (13 von 21 Patienten) Unterstützung der Hypothese, daß C13 ein Tumorsuppressorgen ist BRCA2 C 13 13 RB1 Chromosom 13 Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

Weitere Gene involviert in die Prostatakarzinogenese Grundlagen Telomerase angiogene Wachstumsfaktoren Gene der Apoptose CD 44

Faktoren der Metastasierung Grundlagen Faktoren der Metastasierung Zell-Adhäsionsmoleküle E- Cadherin a- Catenin Metalloproteinasen und Inhibitoren MMP TIMP Angiogene Faktoren VEGF und Rezeptoren

Isolierung des putativen Tumorsuppressorgens Cyr 61 Grundlagen Chromosom 1p22 verminderte Expression im PCa-Gewebe epithelspezifisch extrazelluläres Signalprotein, matrixgebunden Modulator der Zelladhäsion und Zellinteraktion Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden 6

Diagnostik beim PCa Primärdiagnostik: Digitale rektale Untersuchung Serum-PSA Bestimmung transrektaler Ultraschall Histologie der Biopsien Metastasierung: Skelettszinthigraphie CT Thorax und Abdomen (PET)

Verbesserte Diagnostik Verbesserung der Primärdiagnostik bei Serum-PSA 4-10 ng/ml Verbesserung von Staging und Prognose sensitiver molekularer Nachweis von PCa-Zellen in Blut, Biopsien, regionären Lymphknoten

Nachweis von PCa- Zellen mittels RT-PCR Diagnostik Bestimmung der Menge an PCa-Zellen (Staging) Feststellung der Ex- pression spez. Tumor- marker (Prognose) Aufschluß des Gewebes Isolierung der Gesamt-RNA Umschreibung in cDNA Transkript-spezifische PCR

Qualitative und quantitative Bestimmung von Transkripten Diagnostik Prostataspezifische Transkripte Tumorspezifische Transkripte Telomerase c-src Survivin Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) Somatostatin-Rezeptor Typ 1 Prostata spezifisches Antigen (PSA) Membranantigen (PSM) Humanes Kallikrein (hK2) 9

Prostataspezifische mRNA‘s Diagnostik Prostataspezifische mRNA‘s PSA (Prostata Spezifisches Antigen) PSM (Prostata Spezifisches Membranantigen) Serinprotease Lokalisation: Serum Größe: 34 kDa Transkripte: PSA mRNA Folathydrolase Lokalisation: Plasmamembran Größe: 94 kDa Transkripte: PSM mRNA PSM’ mRNA PSM’’ mRNA 12

Qualitativer Nachweis von PSM-Transkripten in Lymphknoten 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1-3, 5-7: Lymphknoten RNA 8: pos. Kontrolle (LNCaP RNA) 9: neg. Kontrolle 10: 123 bp DNA-Standard Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

Quantitativer Nachweis von PSA-Transkripten Diagnostik 1.0 Fluoreszenz 0.10 45 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Anzahl der Zyklen Wasser Standard 10 pg Standard 1 pg Standard 100 fg Standard 10 fg pos. PCa-Zellen Patient 1 LK Patient 2 LK Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden

Nachweis von PSA-Transkripten in regionären Lymphknoten Diagnostik n RT-PCR- RT-PCR- PSA + PSM RT-PCR- PSM‘ PCa/N+ 17 12 16 15 PCa/N- 37 0 35 37 PCa 54 12 51 32 RCC 3 0 3 2 kein Ca 2 0 0 0 Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden 15

Therapie des PCa Operation - radikale Prostatektomie Hormontherapie Strahlentherapie 14

Molekulare Grundlagen der Hormonresistenz Therapie Androgenrezeptor Steroidrezeptoren EGF-Rezeptor MDR-1 (Multi-Drug Resistenz-Gen)

Molekulare Therapie- ansätze für das PCa Inhibitoren von Wachstumsfaktoren Anti-Angiogene Faktoren Gentherapie 14

Signalkaskade des EGF-Rezeptors Therapie EGF EGF EGF-Rezeptor Ras SOS Raf GRB2 Kinase Kinase c-src Mitogenese Shc c-myc PLCy MEK MAPK c-fos Ziel-Gen c-jun

Gentherapeutische Ansätze beim PCa Immun-Gentherapie Suizidgentherapie Inhibierung von Onkogenen Expression von Tumorsupressorgenen

Immun-Gentherapie mit Antigen Präsentierenden Zellen (APC) Adenoviraler Gentransfer (PSA, PSM) Antigen expr. APC’s + GM-CSF, IL-4 nach Ficazzola and Taneja, 1998

Klinische Studien (NIH approved) I Strategie Verabreichung Autor Vektor/Ther. Gen Immuntherapie Tumorvaccine Gansbacher Retrovirus: IL-2 ex vivo Tumorvaccine Simons Retrovirus: GM-CSF Tumorvaccine Paulson Liposome: IL-2 Immuntherapie systemisch Chen Vaccine: PSA in vivo systemisch Kufe Vaccine: PSA systemisch Sanda Vaccine: PSA intratumoral Simons Adenovirus: PSA intratumoral Belldegrun Liposome: IL-2 nach Ficazzola and Taneja, 1998

Induzierung des Zelltodes Therapie Suizidgene: Cytosin-Desaminase (CD) Herpex-Simplex-Thymidin- Kinase (HSV-tk) Ganciclovir 5’-Fluorcytosin (5-FC) HSV-tk CD Ganciclovir- P 5’-Fluorouracil (5-FU) zelluläre Enzyme Ganciclovir- P-P-P

Induzierung des Zelltodes durch HSV tk/GCV Therapie adenoviraler Vektor intraprostatische Injektion i. v. GCV CMV Prom. HSV tk klin. Phase I: 18 Patienten nach Radiotherapie lokales Rezidiv, keine Metastasierung 4 ADV-Konzentrationen Ergebnis: PCR Nachweis des Vektors im Urin keine Wachstum des ADV in Blut- oder Urinproben 4 Patienten Grad 1-2 Toxizität 1 Patient Grad 3-4 Toxizität 3 Patienten mind. 50 % PSA-Abfall (6-52 Wochen) Herman et al., 1999

Therapie mit Antisense-Oligonukleotiden Translation X DNA mRNA Amino säuren Ribosom Protein

Antisense-Behandlung von PCa-Zellen Verringerung der Viabilität von DU 145-Zellen nach Antisense- Telomerase- Behandlung 3 5 µM AtRT 2,5 10 µM AtRT 15 µM AtRT 2 Kontrolle 15 µM NS 1,5 Viabilität 1 0,5 6 12 18 24 30 36 42 48 Zeit (Tage) Klinik für Urologie Universitätsklinikum Dresden 1

Tumorsuppressorgenen Expression von Tumorsuppressorgenen p53-Expression adenoviraler Vektor CMV Promotor p53 p 53 klin. Phase I/II: intraprostatische neoadjuvante Therapie 17 Patienten mit lokal fortgeschrittenem PCa 3 Injektionen (14 Tage Abstand) Ergebnis: keine Grad 3 und 4 toxischen Effekte 3/14 Patienten: 25% Reduzierung der Tumorgröße Logothetis et al., AUA 1999

Klinische Studien (NIH approved) II Strategie Verabreichung Autor Vektor/Ther. Gen Suizidgen intratumoral Kadmon Adenovirus: HSV-tk intratumoral Scardino Adenovirus: HSV-tk intratumoral Hall Adenovirus: HSV-tk Tumorsuppressor intratumoral Belldegrun Adenovirus: p53 intratumoral Logethetis Adenovirus: p53 Anti-Oncogen intratumoral Steiner Retrovirus: Myc-antisense nach Ficazzola and Taneja, 1998

Das urologische Forschungslabor Prof. Dr. M. P. Wirth Dr. Ulrike Fiedler Susanne Füssel Uta Schmidt Wibke Ehlers Dr. Andres Melchior Birgit Noack Ascan Schindler Jörg Stade Romy Kranz Jana Herrmann Silke Tomasetti