Nachweis des Epithelialen Wachstumsfaktor Rezeptors (EGFR) und der cytoplasmatischen Tyrosinkinase c-src in Urothelkarzinomzellen A. Melchior, J. Herrmann, S. Tomasetti, M. P. Wirth, U. Fiedler Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden Patienten und Methode: Es wurde Gewebe (tumor und tumorfrei) von vier Patienten mit Urothelkarzinom der Harnblase sowie die TCC-Zellinien EJ28, J82, HT1376 und 5637 untersucht. Die Proteine wurden durch Homogenisierung der Proben und anschließende Aufnahme in einem Lysis-Puffer bzw. ausschließlich durch eine Zelllyse gewonnen. Für die Western-Blot Analysen wurden µg der Gesamtproteinmenge zur Detektion von EGFR und c-src eingesetzt. Von den gleichen Ausgangsmaterialien wurde RNA isoliert, die in cDNA umgeschrieben wurde. Die cDNA diente als Template für die PCR-Analysen. Es wurden Primer entwickelt und verwendet, die spezifisch für EGFR, c-src und GAPDH sind. GADPH ist ein ubiquitär vorkommendes Protein und wurde zur Quantifizierung der cDNA-Menge eingesetzt. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden nach Auftrennung im Agarosegel analysiert. Einleitung: Die Tyrosinkinasen Epidermaler Wachstumsfactor- Rezeptor (epidermal growth factor receptor EGFR) und c-src sind entscheidende Regulatoren verschiedener Signaltransduktionswege. Eine erhöhte Expression des EGFR wurde bei einer Vielzahl von Tumoren beobachtet und korreliert mit dem Wachstum von Metastasen und der Migration von Zellen. C-src ist in die Mitogenese der Zellen involviert und wird ebenfalls in vielen Karzinomen überexprimiert. Beide Tyrosinkinasen scheinen im Prozeß der Karzinogenese wechselzuwirken bzw. zu kooperieren. Innerhalb der hier vorgestellten Studie wurde die Expression von EGFR und c-src in vier Urothelkarzinom (transitional cell carcinoma TCC)- Zellinien sowie bei vier Patienten mit TCC der Harnblase untersucht. Die Menge an gebildeten Proteinen wurde mit Western-Blot-Analysen nachgewiesen, während die mRNA-Konzentration durch eine semiquantitative RT-PCR für alle drei Marker untersucht wurde. Ergebnisse: In allen 4 Zellinien wurde der EGF-Rezeptor immunologisch nachgewiesen, wobei die stärkste Expression bei den Zellinien HT1376 und EJ28 beobachtet wurde (Abbildungen 1 und 2). Allerdings zeigten sich auf mRNA-Niveau bei den Zellinien keine signifikanten Unterschiede in der Expression des EGFR. Hinsichtlich der Expression von c-src zeigte die Zellinie 5637 das stärkste Signal, wobei bei diesem Marker auch die höchste Konzentration spezifischer mRNA festgestellt wurde. Bei den vier Patienten wurde im Western-Blot in drei Proben c-src und in zwei Proben EGFR ausschließlich im Tumorgewebe nachgewiesen. Die Ergebnisse der RT-PCR bestätigten dies. Bei drei Proben wurde EGFR im Tumorgewebe nachgewiesen, wobei sich bei den zwei positiven Proben aus dem Western-Blot ein sehr viel stärkeres Signal gezeigt hat. Schlußfolgerung: Die Untersuchungen mit den Geweben der 4 Patienten mit Urothelkarzinom der Harnblase lassen vermuten, daß die verstärkte Expression von EGFR und c-src auch bei der Karzinogenese der Blase eine entscheidende Rolle spielt. Aus den Ergebnissen der Zellinien läßt sich schlußfolgern, daß die Expression der cytoplasmatischen Tyrosinkinase c-src auf mRNA-Niveau reguliert wird. Dagegen scheint die Expression des EGF-Rezeptors posttranskriptional reguliert zu werden. Die Ergebnisse könnten bei der Entwicklung neuer Therapieansätze für das Urothelkarzinom, die auf der Hemmung der mRNA-Expression der beschriebenen Marker basieren, hilfreich sein. Abbildung 1: Immunhistologische Darstellung des EGF- Rezeptors bei der Zellinie EJ28 Abbildung 2: Kontrolle (EJ28) C-src (80µg/lane) Zusammenfassung: Es wurde die Expression von EGFR und c-src in vier TCC-Zellinien sowie bei vier Patienten mit TCC der Harnblase untersucht. Die Menge an gebildeten Proteinen wurde mit Western-Blot- Analysen nachgewiesen, während die mRNA- Konzentration durch eine semiquantitative RT- PCR für alle drei Marker untersucht wurde. Die Untersuchungen unterstützen die Vermutung, daß die verstärkte Expression von EGFR und c- src auch bei der Karzinogenese der Blase eine entscheidende Rolle spielt und daß die Expression der cytoplasmatischen Tyrosinkinase c-src auf mRNA-Niveau reguliert wird. Die Expression des EGF-Rezeptors hingegen scheint posttranskriptional reguliert zu werden. Die Ergebnisse könnten bei der Entwicklung neuer Therapieansätze für das Urothelkarzinom, die auf der Hemmung der mRNA-Expression der beschriebenen Marker basieren, hilfreich sein. Abbildung 3: EGFR in Tumor (tu) und tumorfreien (tf) Zellen bei sechs Patienten mit Prostatakarzinom (PCR) 123 bp St. SH tu SH tf FI tu FI tf LG tu LG tf HW tu HW tf PW tu PW tf HgW tu HgW tf DU 145 frei 123 bp St. EGF Kinase EGF Shc GRB2 Ras SOS MEK MAPK Mitogenese Ziel-Gen c-fos c-jun c-src PLCy Raf EGF-Rezeptor c-myc