Labor-Seminar 07.02.2007 Juliane Schmidt Und ganz viele Helfer! „Evaluierung und Validierung potenzieller molekulargenetischer Tumormarker in Urinproben von Patienten mit Verdacht auf Harnblasenkarzinom“

Einführung Harnblasenkarzinom (BCa) Vierthäufigster Tumor beim Mann weltweit & neunthäufigste Ursache eines tumorbedingten Todes Zystoskopie (invasiv) & Urinzytologie: Standardmethoden zur Diagnose und Überwachung kein idealer BCa-Tumormarker zur nichtinvasiven Diangostik

Zielstellung Etablierung standardisierter Methoden zur quantitativen Transkriptmessung in Geweben (TUR-Späne) und Urinproben Targetvalidierung an Gewebeproben (Tu-Tf) Evaluierung verschiedener tumorassoziierter Faktoren (Survivin, XIAP, Ki67) als mögliche diagnostische und prognostische BCa-Marker

BCa-assoziierte Gene Survivin & XIAP: “inhibitor of apoptosis proteins” (IAP) Ki67: Proliferationsmarker, essential für Zellzyklus selektiv überexprimiert in vielen Tumorarten inkl. BCa Assoziation zwischen Überexpression und höherem Tumorstadium & Grad sowie mit ungünstiger Prognose ( SVV+Ki67 ) geeignete Marker (Literatur: Gewebe und Urin) und therapeutische Targets für Antitumortherapien (z.B. Antisense- Studie)

Material & Methoden 1 prospektive Studie: Februar 2006 – Januar 2007 Einschlusskriterien: Patienten mit Verdacht auf ein BCa (Neudiagnose oder Rezidiv) die sich einer transurethralen Resektion (TUR-BT) unterziehen Ausschlusskriterien: Patienten mit zusätzlichem Prostata-Ca Patienten mit gutartigen Veränderungen ( z.B.Papillom ) Patienten mit nicht-urothelialen Karzinomen (z.B.Adeno-Ca)

Material & Methoden 2 Kontrollgruppen: BPH-Patienten Cystitis-Patienten Gesunde Cystektomiepatienten ( Sammlung läuft noch )

Material & Methoden 3 BCa-Patienten: Kontrollen: 1 Urinprobe prä-operative Urinprobe intra-operatives Gewebe (Tumor & scheinbar normale Blasenmucosa) post-operative Urinprobe (Sammlung ge- stoppt) für jede TUR-BT (prim./sek./tert., aller 4-6 Wo.) gleicher Zyklus auch bei Rezidiven Kontrollen: 1 Urinprobe

Behandlungsverlauf eines Blasenkarzinompatienten Rezidiv Primäre TURBT ca. 6-8 Wochen Rezidiv Sekundäre TURBT Cystektomie ca. 6-8 Wochen Tertiäre TURBT Cystektomie

Material & Methoden 4 Sedimentation der Zellen aus dem Urin Gewebekryoschnitte (Tf = 0%, Tu = 70-100%) Isolation von total RNA und cDNA-Synthese quantitative PCR für Survivin, XIAP & Ki67 und das Referenzgen TBP in Urin- & Gewebeproben Korrelation der relative Expressionsniveaus von Survivin, XIAP & Ki76 (interne Normalisierung auf TBP) mit klinisch-pathologischen Aspekten

Bca-Patienten (N=106) BT= 89 ( 84% ) NT= 17 ( 16% ) Alter (median) = 70 Jahre (34 – 93) M:F = 63 : 43 (59,4% : 40,6%) Neudiagnose : Rezidiv = 92 : 14 (86,8% : 13,2%) PSA (median; 58 Pat.) = 1,195 (0,16 – 33,91) Tumorstadien: NT= kein Tumor nachweisbar n=17 pTa n=56 pT1 n=15 >PT1 n=17 NA n=1 cis: 92 :14 (86,6% : 13,2%) Tumorgrade: NT n=17 LMP (low malignancy potential) n=6 low grade n=17 high grade n=66

Kontrollen BPH: n =34 67,5 Jahre (52-85J.) PSA-Median 2,105ng/ml (0,28-21,58) Cystitis: n =6 49,5 Jahre (19-76J.) M : F = 1:5 Gesunde: n =30 30 Jahre (18-59J.) M : F=7:22

Cytologie 36% 92% 75% 78% Vergleich mit unseren Daten folgt Negativ prädiktiver Wert (npW) Positiv prädiktiver Wert (ppW) Spezifität Sensitivität Vergleich mit unseren Daten folgt

Ergebnisse 1 2 Referenzgene getestet: TBP besser als HPRT Urinproben: negative Korrelation zw. Referenzgen- Expression & Erythrozyten / Leukozyten  viele Proben mit Ref.gen unter Nachweisgrenze von 10 Transkriptmolekülen Gewebeproben: weniger Proben mit neg. Referenzgen aufgrund technischer Probleme viele der ersten Proben verworfen oder cDNA nicht mehr ausreichend für vollständige Messung aller Gene

Ki67/TBP in ungepaarten Gewebeproben

XIAP/TBP in ungepaarten Gewebeproben

SVV/TBP in ungepaarten Gewebeproben

Ki67/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen Gesunde: fehlende Werte Null gesetzt

XIAP/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

SVV/TBP in Urinen von BCa-Patienten und Kontrollen

Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorstadium

Ki67/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

XIAP/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

SVV/TBP in Urinen in Abhängigkeit vom Tumorgrad

Schlussfolgerungen Eignung als Tumormarker: Ki67,(SVV) Abhängigkeit vom Tumorstadium: Ki67,SVV Abhängigkeit vom Tumorgrad: Ki67,(SVV) XIAP ungeeignet: Expression im Prostata- gewebe => bei BPH Expression in Leukozyten => bei Cystitis

Ausblick 1 gezielte Nachbeobachtung von Patienten ohne histologischen Tumornachweis (NT) Abfall der Tumormarker nach der primären TUR-BT? Statistische Signifikanz: möglich durch Kombination der Tumormarker ? (Verweis auf Prostata-Krebs-Studie) Ausweitung der Tumorgene ( z.B. hTERT,CK20 ) Vergleich mit Urinzytologie (Cutt-offs?)

Ausblick 2 Geschlechtsspezifischer Test ( Probleme durch Einfluss von BPH ) Korrelation Tumormarker im Urin und korrespondierenden Gewebe Ausschlusskriterium Harnwegsinfekt:  Bakterienzahl oder positive Urinkultur? Sammlung BPH- ,Cystitis-und Cystektomie- Patienten Abschätzung der Rezidivhäufigkeit?