Fetale Zellen im maternalen Blut Bernd Eiben Institut für Labormedizin und Klinische Genetik Rhein Ruhr im Laborverbund wagnerstibbe 45127 Essen © eibenglaubitz 2008

Abortrisiko hierdurch ca. 1% Eine exakte pränatale Diagnostik setzt gegenwärtig einen invasive Eingriff voraus. CVS oder Amniocentese Abortrisiko hierdurch ca. 1% ==> alternativ: fetale Anteile in der mütterlichen Zirkulation © eibenglaubitz 2008

Suche nach fetalen Zelle in der maternalen Zirkulation Trophoblastzellen fetale Leukozyten 4 Ansätze fetale Erythroblasten fetale DNA © eibenglaubitz 2008

Untersuchung mittels histologischer Methoden 100.000 Zellen/d erste Hinweise auf fetale Zellen 1893 durch Georg Schmorl: fand Trophoblastzellen in der Lunge von Patientinnen, die an Präeklampsie verstorben waren Untersuchung mittels histologischer Methoden 100.000 Zellen/d Schmorl, G. (1893) Pathogisch-anatomische Untersuchungen über Publeraleklampsie. Vogel, Leipzig. © eibenglaubitz 2008

Trophoblastzellen in der mat. Zirkulation Trophoblastzellen wurden 1994 erstmals zur Diagnostik einer Häminoglobinopathie verwendet. Hawes et al. (1994): An N Y Acad Sci 173: 181-185 Zellen werden aber in der Lunge absorbiert Plazenta weist viele Mosaike auf sind mehrkernig ==> kein Aneuploidieuntersuchung Trophoblastzellen ungeeignet © eibenglaubitz 2008

fetale Lymphozyten im maternalen Blut seit Ende 1960er Jahre Untersuchung der fet. Lymphozyten Untersuchung mittels zytogenetischer Methoden Lymphos sind leichter anzureichern und zu kultivieren aber: die fetale Lymphocytenproduktion startet erst ab der ca. 20. SSW. è schlechte Ausgangssituation  für eine frühe Diagnostik. aber: absolutes Überwiegen mütterlicher Leukocyten è extreme Selektionsschwierigkeiten zwischen fetalen und maternalen Zellen © eibenglaubitz 2008

==> Lymphozyten sind nicht geeignet fetale Lymphozyten im maternalen Blut Untersuchungen von Bianchi et al. (1996) zeigten, dass männliche fetale T-Lymphocyten (CD 3+; CD 4+) nach 27 Jahren im Blut einer Frau gefunden wurden, die einen Jungen geboren hatte. ==> Lymphozyten sind nicht geeignet © eibenglaubitz 2008

Vorteile: fetale Erythroblasten im maternalen Blut Im 1. Trimenon stellen kernhaltige rote Blutzellen den größten Teil der kernhaltigen Zellen des Feten dar ==> können in die maternale Zirkulation übertragen werden kernhaltige rote Blutzellen fehlen im Blut von Erwachsenen bzw. sind äußerst selten ==> bessere Detektionschance haben eine Lebensdauer von nur ca. 90 d ==> können damit nicht aus einer vorherigen Schwangerschaft stammen. © eibenglaubitz 2008

Vorliegen einer einzelnen fetalen Zelle fetale Erythroblasten im maternalen Blut fetale Erythroblasten : mononukleär geeignete Oberflächenantigene Vorteile: gesamtes fetale Genom ohne maternale Kontaminationen ==> Mögliche Diagnostik von Punktmutationen Vorliegen einer einzelnen fetalen Zelle ==> mögliche FiSH Untersuchung © eibenglaubitz 2008

Untersuchung der fetalen Erythroblasten über FiSH fetale Erythroblasten im maternalen Blut Untersuchung der fetalen Erythroblasten über FiSH Bianchi et al. (1992): Detection of fetal cells with 47,XY,+21 karyotype in maternal peripheral blood. Hum Genet 90: 368- 370 Valerio, D., Altieri, V., Cavallo, D., Aiello, R. and Antonucci, F.A. (2000) Detection of fetal trisomy 18 by short-term culture of maternal peripheral blood. Am. J. Obstet. Gynecol., 183, 222±225. © eibenglaubitz 2008

Analytische Betrachtung fetale Erythroblasten im maternalen Blut Analytische Betrachtung sehr hoher methodischer Aufwand große Kontaminationsgefahr mit maternalen Zellen Allel drop out (Fehlanalyse durch „nicht Amplifikation“ einzelner Loci bei Einzelzellanalysen) © eibenglaubitz 2008

fetale Erythroblasten im maternalen Blut große NIFTY Studie (National Institute of Child Health and Developement Fetal Cell Isolation Study) 3000 klinische Fälle wurden in 5 Zentren mittels MACS oder FACS untersucht ==> fetale Zellen konnten nur mit eine Sensitivität von 50% entdeckt werden Bianchi et al. (2002), Prenat. Diagn. 22: 609- 615 © eibenglaubitz 2008

fetale Erythroblasten im maternalen Blut NIFTY Studie der NIH zeigte deutlich, dass die Anreicherung und Diagnostik aus zirkulierenden fetalen Zellen mit den gegenwärtigen Techniken nicht praktikabel ist! Bianchi et al. (2002), Prenat. Diagn. 22: 609- 615 ==> fetale DNA im maternalen Blut Lo et al. (1997): Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 12: 1904- 1904 © eibenglaubitz 2008

fetale DNA im maternalen Blut Herkunft der cell free fetal DNA: Adoptosis von Trophoblastzellen Bischoff et al. (2005). Hum Repro Update 11: 59- 67 Kann schon 7 Wochen post conceptionem analysiert werden 3- 5% der freien DNA im maternalen Blut ist fetaler Herkunft 1. Präparation über Qiagen Säulen Cell free fetal DNA (cff DNA) ist kürzer als cell free maternal DNA (cfm DNA): 99% cff DNA < 313 bp: Hauptanteil bei </= 145 bp Präparation über Gel Elektrophorese (MG) (Unterscheidung über unterschiedliche Methylierung) cff DNA wird sehr schnell pp vollständig abgebaut © eibenglaubitz 2008

Aneuploidiediagnostik fetale DNA im maternalen Blut Aneuploidiediagnostik 1) Der relative DNA Anteil eines jeden Chromosoms in der freien DNA müsste grundsätzlich gleich sein. Messung einzelner Chrom. 21 Marker und Vergleich zu Referenzmarkern anderer Chromosomen: Relative Chromosomen Dosis ROD ROD Verhältnis 2:2 = Euploid/ Verhältnis 3:2 = Aneuploid Untersuchung chromosomenspezifischer Polymorphismen bei Vater & Mutter Allel Verhältnis (Allel Ratio AR) Bei euploidem Fetus Heterozygot ==> AR 1:1 bei aneuploidem Fetus ==> AR 2:1 Analysen mit hoher Sicherheit können mit nur mit multi copy Sequenzen vom Y Chromosom erfolgen!!!!! © eibenglaubitz 2008

fetale DNA im maternalen Blut bei Präeklampsie ■ Schwangere, die eine Präeklampsie entwickeln, haben bereits Wochen vor Erkrankungsbeginn eine erhöhte Konzentration von fetalen Zellen und fetaler freier DNA im Blut. Zhong XY, Holzgreve W, Hahn S.: Circulatory fetal and maternal DNA in pregnancies at risk and those affected by preeclampsia. Ann N Y Acad Sci 2001; 945: 138–140. ■ 5 fach höhere cffDNA bei Schwangeren mit Präeklampsie Lo et al.: Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in PET. Clin chem 1999; 45; 184- 188 ■ je höher die cffDNA Konzentration ist, desto schwerer der Krankheitsverlauf Schwinkel et al.: Hemolysis, elevated live enzymes and low platele count (HELLP) syndrome as a complication of PET...Clin Chem 2002; 48; 650-653 © eibenglaubitz 2008

Mögliche sichere diagnostische Möglichkeiten: fetale DNA im maternalen Blut Mögliche sichere diagnostische Möglichkeiten: ==> fetales Geschlecht sinnvoll? Ethisch problematisch ==> fetaler Rhesusfaktor bei rh neg. Schwangeren 17% der Deutschen sind Rhesus D negativ 0,4% unvollständige D Ausprägung © eibenglaubitz 2008

fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren Deletion des Rh-D-Gens ist die häufigste Form bei Rhesus-D-negativen Europäerinnen. Aber: Mehrheit der Rh-D-negativen afrikanischen Patientinnen tragen ein Pseudogen (RHDy) oder ein (C)cdes-Allel. In beiden Allelen sind Rh-D-spezifische Sequenzen vorhanden. Aufgrund der Anwesenheit eines Stop-Codons (RHDy) oder des Ersatzes der Rh- D-spezifischen Sequenzen bei Rh-CE-spezifischen Sequenzen ([C]cdes) keine D-Epitope auf den Erythrozyten feststellbar. ==> Sonderformen müssen mitberücksichtigt werden Molekülgrösse fetaler DNS von <300 bp zu beachten Sensitivität von >99% erforderlich Wegen unterschiedlichen Varianten des Rh-D-Genes ist eine «Multiplex»-PCR notwendig, in welcher verschiedene Regionen des Rhesus-D-Genes amplifiziert werden. © eibenglaubitz 2008

fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren © eibenglaubitz 2008

fetaler Rhesusfaktor bei Rh D neg. Schwangeren Annahme: Rhesus Typisierung direkt nach Geburt 96,7%: anti-RhD Prophylaxe nur bei pränatalem Nachweis Rh D pos. 99,7%: anti-RhD Prophylaxe bei pränat. Nachweis Rh pos., unbestimmt & Rh. Varianten Risiko einer Alloimmunisierung bei anti-RhD Prophylaxe post Partum: ca. 1% bei anti-RhD Prophylaxe pP & pränatal: 0,3% © eibenglaubitz 2008

fetale DNA im maternalen Blut © eibenglaubitz 2008

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Fazit Fetale Zellen/ DNA in der maternalen Zirkulation Die meisten Anwendungshoffnungen haben sich nicht erfüllt! Realisierbar sind gegenwärtig die Bestimmung Marker wie Rhesus oder y Chromosom Anteile, die bei der ggf. Mutter nicht vorhanden sind! © eibenglaubitz 2008