Zuchtmethodik und quantitative Genetik in der Pflanzenzüchtung - Übungen 951321 University of Natural Resources and Applied Life Sciences, Vienna Department IFA - Tulln Übung: Auswertung und Erfassung von Mikrosatelliten- und AFLP-Gelen, Überprüfung der Aufspaltung, Prüfung auf Kopplung mit Chi2 –Test, Berechnung der Rekombinationsrate Folien Link aus : Barbara Steiner BOKU-University of Natural Resources and Applied Life Sciences Vienna, Department IFA-Tulln, Institute for Biotechnology in Plant Production, Konrad Lorenz Str. 20, A-.3430 Tulln, Austria

SSR: GWM 720 Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B SSR: GWM 1121 Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B

AFLP Selektive Primer: Mse GC Sse AC

AFLP Mse GC Sse AC Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B

aflp1 aflp2 aflp3 AFLP Mse GC Sse AC Lane 1: Chinese Spring, Lane 2: Elter A, Lane 3: Elter B, Lane 4 bis 63 DH-Linien Nachkommen Elter A *Elter B aflp1 aflp2 aflp3

Mikrosatelliten oder: SSR Simple Sequence Repeat, STR Short Tandem Repeat, STMS Sequence-Tagged Microsatellite site, SSLP Simple Sequence Length Polymorphismus Variable Wiederholung von einfachen Sequenzen (2-5 Nukleotide, Minisatelliten 10-15). Flankierende Regionen sind innerhalb einer Art konserviert. Polymorphismen durch unterschiedliche Anzahl der repeats – INDEL Polymorphismen; Mikrosatellitenmotive sind gleichmäßig über das Genom verteilt und kommen auch in Genen vor – EST-abgeleitete SSRs; A --------------GAGAGAGAGAGAGAGAGA------------------------- B ----------------GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGA------------ A B A/B Die bekannteste Anwendung von Mini- und Mikrosatelliten ist das DNA-Fingerprinting (Jeffreys et al. 1985).

Detektion von Mikrosatelliten Polymorphismen beruhen auf INDELs, Detektion = Fragmentgrößenbestimmung Gel-basierende Systeme Agarose Gele Hochauflösende Agarosegele Native Acrylamidgele Sequenziergele (denaturierende Acrylamidgel) Agarosegel (2.5%) Acrylamidgel (6%) SSR Marker Tom316 auf 10 Tomatenlinien. Acrylamidegel hat bessere Auflösung! Pavan et al. (2008): Euphytica 162: 91-98, Sequenziergel: denaturierendes Polyacrylamid, 6%ig (LI-COR®), sehr gute Auflösung bis 2 bp Unterschied

Detektion von Mikrosatelliten 201 199 197 195 193 191 189 187 185 Kapillare Elektrophorese Kapillare Sequenzierer Chip Elektrophorese Bsp: Kapillare Elektrophorese von SSR Marker Fragmentlänge von 185 bis 201 bp Detektion mittels Fluoreszenz Größenbestimmung relativ zu Standard Semi-automatische Analyse möglich Source: http://www.traitgenetics.com

Vor- und Nachteile von Mikrosatelliten + sehr gut reproduzierbar, wenig DNA nötig + ko-dominant + Locus spezifisch und viele SSR Marker sind genetisch kartiert + einfache Handhabung und sehr gut automatisierbar + hohe Zahl an Allelen in einem Mikrosatellitenlocus + direkt verwendbar in der marker-gestützten Selektion Entwicklungskosten aufgrund des Sequenzierungsbedarfs - nicht für alle landwirtschaftlichen Nutzpflanzen entwickelt Anwendung Wichtiger Markertyp für die praktische Pflanzenzüchtung: Marker-gestützten Selektion, Sortenidentifizierung, genetische Diversitätsstudien, „Ankermarker“ zum Erstellen von genetischen Karten, kartieren von wichtigen Merkmalen;

AFLP-Marker Amplified Fragment Length Polymorphism Die AFLP®-Technik (Keygene 1993 Zabeau & Vos) ist eine beliebte Technik für DNA-fingerprinting. Kombination aus Restriktionsverdau mit einem/zwei Enzymen und 2-Schritt-PCR-Amplifikation Polymorphismen durch Mutation in der Restriktionsschnittstelle und INDELs. Owner: http://www.keygene.com Vos et al. (1995) AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acids Res. 11: 4407–4414.

AFLP-flow-chart +1 +2 +3 +4 selective nukleotides

Beispiel für ein AFLP-Gel Verdau mit den Enzymen Sse8387I und MseI Selektive primer Kombination MseAA/SseTT BC1F5 lines von Triticum durum x Triticum dicoccum Cy5 markierte Fragmente, visualisiert auf einem Fluoreszenzscanner (Typhoon TRIO)

* * AFLP-Elektropherogramm Ausschnitt mit 25 Gelspuren und 14 Polymorphismen, AFLP sind überwiegend (ca. 90% der AFLP) dominante Marker auswertbar: Bande vorhanden oder Bande fehlend * * ca. 10% der AFLP Marker sind ko-dominant auswertbar * Parent 1 Parent 2

WS 2014/15 Zuchtmethodik und quant. Genetik - Übungen 951321 Beispiel 2: Auswertung für dominanten AFLP-Marker ABAACACACAACCAAAACCACAACA ABDBDDDBDBDDBDDBDDDDDDDDD ABAAAAAAAABBAACAAAAAABAAA ABDDDDDDDBBDDDDDDDBDBDDBD Diese beiden AFLP Banden gehören wahrscheinlich zu einem ko-dominanten AFLP Marker, daher gemeinsame Auswertung mit A, B, H möglich ABCAACAAAAAAAACAAAACAAAAA ABDDDDDDBDBBBBDDBDDDDDDDD Und so weiter…. nach unserer Erfahrung ca. 10% der AFLPs ko-dominant e Marker (Polymorphismus : INDEL zwischen Primerbindungsstellen) WS 2014/15 Zuchtmethodik und quant. Genetik - Übungen 951321 Elter 1 Elter 2

Vor- und Nachteile von AFLP-Markern + universell einsetzbar + keine Sequenzinformationen nötig + sehr gute Reproduzierbarkeit + große Fragmentanzahl pro PCR (50-150 Banden) daher effiziente Methode zur Polymorphismusdetektion + wenig DNA notwendig + mit wenigen Primern große Anzahl an Kombinationsmöglichkeiten AFLPs sind meist dominante Marker und ‚anonyme‘ Marker sehr gute DNA-Qualität ist nötig technisch herausfordernd - AFLP-Gele sind oft schwierig auszuwerten - keine direkte Anwendung in der marker-gestützten Selektion möglich 15