Block: „Molekulare Zellbiologie von Immunzellen“ SS 2008 Ergebnispräsentation: „Klonierung von Cytohesin-Mutanten“ Referent: Marcell Louis
Klonierung von Cytohesin-Mutanten: Einführung von Punktmutation in Cyh-1 E157K R281K V. a. zur Strukturaufklärung von Proteinen
PCR-Mutagense: 1. Schritt: E157K 471bp 723bp R281K 843bp 351bp (Splicing by Overlap-Extension) 2. Schritt: 1,194 kb
Gelbilder der PCR-Mutagenese und SOEing-PCR: Marker Mutagenese: Marker SOEing: E157K R281K 843bp 947 831 E157K R281K 564 723bp 1375 351bp 947 471bp 1194bp 1194bp Daraufhin: Reinigung (CHCl3/Phenol) + Fällung
Verdau: Kontrolle des Verdaus Cyh-1 (mutiert) ~ 1,2 kb Marker NotI Kontrolle des Verdaus MluI Marker Verdaukontrollen 4,7 kb Restriktionsenzyme: MluI A/CGCGT NotI GC/GGCCGC Nach Verdau: Dephosphorylierung der 5‘-Enden verringert Religationswahrscheinlichkeit
Verdau-Kontrolle des Plamids: Unverdauter Vektor Marker 4,7 kb 4,2-4,9kb Vektor (verdaut) Verdau-Kontrollen der Vektoren Low-Melting-Gel erleichtert Isolierung der DNA Isolierung durch Exzision unter UV-Licht
Ligation/Transformation/‘Minipräp‘: Isolierte Insert- und Verktorstränge: Hitzeschock T4-DNA-Ligase Ampicillin Minipräparation
Testverdau der ‚Minipräp‘: ~ 1,2 kb Verdau 4,7 kb Ansätze/ Klone Marker 4973 DB 4,7 kb 4268 ~ 1,2 kb 1375 941 Klone erfolgreich
Testverau/‚Minipräp‘: Erfolgreiche Klone werden in größerem Maßstab angezüchtet Aus der sog. Maxipräparation reinigt man die Plamide auf (CsCl-Gradient) Zum Schluss: DNA-Konzentrationsbestimmung im Fotometer: (Ergebnis leider sehr niedrig, also kein Paradebeispiel)
Ende: Vielen Dank! Außerdem bedanke ich mich bei ‚Wikipedia‘, aus der ich meine (umgeänderten) Abbildungen benutze.