Strukturbasiertes phage display.

Präsentation zum Thema: "Strukturbasiertes phage display."—  Präsentation transkript:

1 Strukturbasiertes phage display

2 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Institut für Biotechnologie Arbeitsgruppe Proteintechnologie Ulrike Fiedler Gerald Böhm Rainer Rudolph Carola Reimann

3 Phage display und panning
Selektionsprozess eluierter Phage lösliches Protein

4 Structure of Antibody Molecules
Complete antibody Active site Active site Light chain Heavy chain Intra-chain- disufide bonds Inter-chain disulfide bond IgG molecule Catalytic antibody

5 Application of Antibodies
Diagnostics tumour diagnosis ELISA Therapy cancer Monitoring detection and quantification of bacteria, toxins, viruses, pesticides Purification affinity chromatography bioremediation

6 Antibodies Advantages Disadvantages Affinity Specificity Size
Immunogenicity Low stability

7 Phagenspezies für das phage display
filamentöse Phagen lytische Phagen Expression in der E. coli-Zelle periplasmatisch zytoplasmatisch Plasmamembran äußere Membran

8 Verwendung von single-chain Fv Antikörpern beim phage display

9 Anwendungen des phage display-Systems
Display natürlicher Peptide: Epitop-Mapping von Antikörpern Herstellung von Immunogenen Display von Random-Peptiden: Epitop-Mapping von Antikörpern Identifizierung von Peptid-Liganden Mapping der Substratbindungsstelle von Proteasen und Kinasen Display von Proteinen und Isolierung von hoch-affinen Antikörpern Protein-Domänen: cDNA Expressions-Screening directed Evolution

10 Scaffolds für das phage display
Cys2His2- Zink-Finger Z-Domäne vom Protein A Tendamistat Cytochrome b562 Zn

11 Ziel des Projektes Design eines stabilen Proteins mit Bindungseigenschaften Anforderungen an das Scaffold-Protein: - kleines Protein - hohe Stabilität - geringe Immunogenität

12 Das Augenlinsenprotein Gamma-Kristallin -ein scaffold für das phage display?

13 Eigenschaften des Gamma-Kristallins
sehr stabiles Protein kleines Protein kaum immunogen Kristallstruktur vorhanden 174 Aminosäuren 2 Domänen 4 b-Faltblätter mit jeweils 4 b-Strängen (greek-keay) Gamma-Kristallin als scaffold: stabiles Protein ohne Bindungseigenschaften

14 Solvent Accessibility
19 17 38 15 2 Accessibility (% of max.) 36 6 4 Residues 1-85 (N-terminal domain)

15 Sequence Variability “Outside” “Inside”

16 Mutagenese im b-Faltblatt
Mutagenisierte Positionen: Lys 2 Thr 4 Tyr 6 Cys 15 Glu 17 Ser 19 Arg 36 Asp 38 Ser 19 Anzahl der möglichen Varianten: 208 = 2.6 E+10

17 Ort der Mutagenense Oberfläche des Gamma-Kristallins: 9122 Å2
Mutagenisierter Bereich: 560 Å2 = 6,1%

18 Konstruktion einer kombinatorischen Gamma-Kristallin-Bank
X X X Design der Oligonukleotide Assemblierung Klonierung Expression and Selektion X X X X X X X

19 Assemblierung der Oligonukleotide
Kodon-Nutzung N/N/N Kodone für eine Aminosäure CAT/N/N kein Stop-Kodon, kein Cystein, keine aromatischen Aminosäuren N/N/K (T or G) Kodone für eine Aminosäure Tripletts Kodone für eine randomisierte Amiosäure Assemblierung an der Festphase SA-coated paramagnetic bead X X X X X X X X X X X X X

20 Ergebnisse und Probleme
Herstellung der Bank Größe der Bank Qualität der eingesetzten Oligo’s Expression der mutierten Proteinen Etablierung des phage display-Systems (scFv) Bildung des Fusionsproteins Display auf dem Phagen Gamma-Kristallin-WT-Protein 3 Stabilität der mutierten Proteine Panning Selektion geeigneter Targets und panning-Bedingungen

21 Target Molecules Haptens oxazolone, abscisic acid, biotin,
digoxigenin, testosterone Proteins BSA, Il4-receptor CEA (carcinoembryonic antigen) tetanus toxoid SH2-domain EGF-receptor Glycoproteins EGP 2 (epithelial glycoprotein)

22 Erste Zielmoleküle Haptene: Oxazolone Proteine: BSA Biotin Lysozym
CD 44 (Oberflächenprotein bei Krebszellen) Enzymatische Glucosidase Aktivitäten:

23 Weiterführende Arbeiten
Gamma-Kristallin-Bänke unter Verwendung von Triplett-Oligonukleotiden Display einzelner Gamma-Kristallin-Domänen oder Gamma-Kristallin-Cystein-Mutanten auf dem Phagen Untersuchung der Wechselwirkungen mit dem BIACORE Stabilitätsuntersuchungen

24 Ausblick weitere Mutagenesen: loop-Region, Region zwischen N- und
C-terminaler Domäne random - DNA-shuffling Fusion der isolierten Kristallin-Mutanten mit dem VP1-Molekül (Targeting Modul) Panning: an lebenden Zellen (zellspezifische Targeting-Module)