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MAXIMAL METHODISCH Das Methodenseminar 25.07.2005 Lena Wronski DNA-Sequenzierung MAXIMAL METHODISCH Das Methodenseminar 25.07.2005 Lena Wronski
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Kettenabbruchmethode nach Sanger Maxam-Gilbert-Methode Sequenzierung durch Hybridisierung Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Kettenabbruchmethode nach Sanger Maxam-Gilbert-Methode Sequenzierung durch Hybridisierung Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Prinzip enzymatische Neusynthese von DNA Analyse der neusynthetisierten DNA Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Prinzips des Kettenabruchs Bausteine der DNA-Neusynthese: dNTPs (N= A, C, G oder T) Sequenzreaktion: ddNTPS im Reaktionsmix bei Einbau keine Verlängerung durch Polymerase Kettenabbruch Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar ddNTPs Didesoxyribunukleosidiphopsphate Maximal Methodisch - das Methodenseminar
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Markierung des Abbruchpunktes Markierung des Primers Markierung der ddNTPs radioaktiv mit Fluoreszenzfarbstoffen (DyeTerminatoren) Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Vorteile der DyeTerminatoren One-Tube Reaktionen keine Termination sites keine markierten Primer nötig Verhältnis dNTPs/ddNTPs bestimmt Sequenzlänge direkte Sequenzierung von PCR-Produkten möglich Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Sequenzreaktion AGCCTGAAGGACTTAGCGTAACA TCGGAC TCGGACT TCGGACTT TCGGACTTC TCGGACTTCC TCGGACTTCCT TCGGACTTCCTG TCGGACTTCCTGA TCGGACTTCCTGAA Polymerase + dNTPS + ddNTPS + Primer Maximal Methodisch - das Methodenseminar
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Maximal Methodisch - das Methodenseminar Auftrennung der entstandenen Fragmente durch Gelelektrophorese Kleine DNA-Fragmente laufen schnell, größere bleiben zurück Vorteil der Laserdetektion: Endpunktdetektion größere Fragmente können noch unterschieden werden lesbare Sequenzlänge nimmt zu Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Hier noch Abi-Maschine einfügen!!! Maximal Methodisch - das Methodenseminar
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Maximal Methodisch - das Methodenseminar Ablauf DNA-Präparation (PCR) Aufreinigung des Produkts Sequenzreaktion Aufreinigung Sequenzierung Datenauswertung Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar DNA-Präparation Qualität WICHTIG unbedingt Kit-Protokollen folgen Quantität WICHTIG Photometer Gelabschätzung Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Aufreinigung von PCR-Produkten Abtrennung von überschüssigen Primern, dNTPs, Salzen Gelsäulen (z.b.QiaQuick PCR-Purification Kit) Verdau mit SAP und Exo1 Gelelution Fällung: 4M Ammoniumacetat Filtermembran (Centricon, Microcon) Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Sequenzierprimer 22-24mer Bindungsstelle ca 50bp vor der eigentl.Sequenz Basenzusammensetzung ausgewogen G/C-Gehalt ~50% 3‘Ende: G oder C Tm >50°C evtl PCR-Primer übernehmen? Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Möglichst vermeiden: Primer-Dimere Sekundäre Bindungsstellen Sekundärstrukturen Repeats Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Template-Menge Template Erforderliche Menge PCR-Produkt 100-200bp 200-500bp 500-1000bp 1000-2000bp >2000bp 1-3ng 3-10ng 5-20ng 10-40ng 40-100ng Einzelstrang-DNA 50-100ng Doppelstrang-DNA 200-500ng große DNA(BACs, PACs, Cosmide etc) 0,1-1,0ug Bakterien-DNA 2-3ug Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Reaktionsansatz Sequenzier-PCR Reagenz Konzentration Volumen Reaktionsmix 2,5x 4ul Puffer 5X 2ul Primer - 3,2pmol Template s.Templatemenge Wasser ad 20ul Endvolumen 20ul Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Aufreinigung nach Sequenzierreakton Spin Column/Plate Zeit zwischen Herstellung und Verwendung? Ladevolumen? Zentrifuge, Parameter? Fällung Temperatur? Zentrifugation? Mischen? Ethanolreste vermeiden! Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Auswertung DNA-Star, Sequence Analysis Sequencher Freeware: CHROMAS (http://www.technelysium.com.au/chromas.html) AbiView (http://bioinformatics.weizmann.ac.il/software/abiview/abiview.html Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Gute Daten Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Basecalling Algorithmus zur „Filterung der Rohdaten“ Achtung! Basecaller und DyeSet müssen zusammenpassen! Dyeset richtet sich nach Art des DyeTerminator Mix! Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Chromatogramm Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Annotations Anmerkungen des Analyseprogramms zu Signalstärke, Lauflänge Spacing (Abstand der einzelnen Signale) Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Troubles die häufigsten Phänomene DNA Template-Menge zu viel zu wenig Template-Qualität Kontaminationen Inhibitoren Salze Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Troubles die häufigsten Phänomene Primerqualität Restprimer Primer-Dimere Qualität (Alter? wie oft schon verwendet? Wie oft aufgetaut/eingefroren?) Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Troubleshooting Parameter zur Problemerkennung Chromatogramm Signalbild Hintergrund (Rauschen Reichweite Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Troubleshooting Parameter zur Problemerkennung Rohdaten Intensitäten unspezifische Signale Annotations relative Signalstärke Spacing Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Zur Erinnerung – so sehen gute Rohdaten aus Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Sequenzreaktion fehlgeschlagen Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Zu viel Template Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Zu viel Template Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Zu wenig Template Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Gemischte Sequenzen -mehrere Templates im Ansatz -mehrfache Primerbindungsstellen Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Kontamination durch mangelhafte Aufreinigung Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Mangelnde Aufreinigung Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Rascher Signalverlust GC-/GT-reiche Regionen, Sekundärstrukturen vorhanden Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Maximal Methodisch - das Methodenseminar Dye Blobs zu wenig Template/Kontaminationen, die Dye-Klumpen bilden Maximal Methodisch - das Methodenseminar
Slippage/“Abrutschen“ Sequenz enthält Repeats, Polymerase „rutscht aus“ Maximal Methodisch - das Methodenseminar
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