ToxxsAnalyzer und FADU-Assay Dr. Inka Pfitzner 23.11.2016 Roche, Basel

Übersicht Nukleinsäuren DNA Methoden zur Messung von DNA-Schäden Schäden und Reparaturmechanismen Methoden zur Messung von DNA-Schäden In vitro-Regulatory Assays In vitro-Assays ToxxsAnalyzer FADU-Assay Prinzip Ablauf Proben Beispielhafte Ergebnisse

DNA - Nukleinsäuren 1.5% der Zellmasse Kettenmoleküle aufgebaut aus Nukleotiden DNA: Desoxyribonukleinsäure RNA: Ribonukleinsäure Speicherung und Weitergabe der Erbinformation vermittelt durch die Desoxyribonukleinsäure (DNS oder DNA) Umsetzung der Erbinformationen in den Aminosäuren-Code der Proteine vermittelt durch verschiedene Klassen der Ribonukleinsäure (RNS oder RNA)

DNA - Nukleinsäuren Stark kondensiert in Form der Chromosomen (1.8 m DNA pro Zelle) Die Gesamtlänge der DNA eines menschlichen Körpers beträgt 1000 mal der Entfernung von der Erde zur Sonne! Quelle: Kintalk.org

DNA - Schäden Jede einzelne Zelle erleidet zwischen 104 und 106 DNA-Schäden (endogen und exogen) pro Tag: Effektives Reparatursystem! Endogen Thermische Spaltung der N-glykosidischen Bindung von Purinbasen – Einzelstrangbrüche Desaminierung von Basen – Punktmutation Oxidative Prozesse – Strangbrüche, Mutationen, Fehlpaarungen Fehlerhafte Replikation - Basenfehlpaarung Exogen Chemikalien – Mutationen, Strangbrüche Strahlen (UV-, Röntgen- und Gammastrahlen): Direkte und Indirekte Wirkung – Strangbrüche, Thymindimere Endotoxine – Strangbrüche Chemotherapeutika: DNA-Interkalatoren, Cross-Linker, Topoisomerase-Inhibitoren 21.09.2018 FADU-Assay 5

Methoden zur Messung von DNA-Schäden In vitro-Regulatory Assays OECD-Richtlinie Endpunkt Ames-Test Salmonella typhimurium- und Escherichia coli-Stämme, die Histidin zum Wachsen benötigen 471 Gen Mutation Nachweis von Punktmutationen in Bakterien, die Substitution, Addition oder Deletion eines oder mehrerer DNA-Basenpaare umfassen Test auf Chromosomenaberrationen in Säugetierzellen (Eine Chromosomenaberration ist eine Anomalie, welche die Struktur oder Anzahl von Chromosomen eines Genoms betrifft) 473 Strukturelle Chromosomenaberrationen Mikroskopische Auswertung Test auf Gen Mutationen in Säugetierzellen (HPRT,- XPRT-Test) 476 Mikrokern-Test mit Säugetierzellen 487 Strukturelle und numerische Chromosomenaberrationen Flow Zytometer Test auf Gen Mutationen in Säugetierzellen (Maus Lymphoma L5178Y TK+/- Test) 490

Methoden zur Messung von DNA-Schäden In vitro-Assays Endpunkt g-H2AX-Immunfluoreszenz-Assay Doppelstrangbrüche Detektion der Phosphorylierung des Histons H2AX am Ser139 als direkte Folge von Doppelstrangbrüchen mithilfe eines spezifischen fluoreszenz-markierten Antikörpers Comet-Assay (Einzelzellgelelektrophorese) Einzelstrangbrüche, Doppelstrangbrüche (je nach Assay-Bedingungen) Nach Lyse der Zellen, ist nur geschädigte, bruchstückhafte DNA in der Lage in einem elektrischen Feld, aus dem Zellkern herauszuwandern = Kometenschweif GreenScreen (Reporter Assay) ‚Genotoxischer Stress‘ Gen für Green-fluoreszent-Protein (GFP) mit GADD45a (Growth arrest and DNA-damage-inducible protein) Promoter verknüpft; Fluoreszenz messbar, wenn GADD45a durch genotoxische Effekte induziert wird. P53-kompetente humane TK6-Zellen LORD-Q (Long-run real-time PCR) Genomische und mitochondriale DNA-Schäden Neuartige PCR-Methode; long-run (~ 4000 bp amplicon), short-run (~ 50 bp amplicon); Ergebnis: Schäden pro 10 kb FADU-Assay Einzel- und Doppelstrangbrüche

ToxxsAnalyzer

ToxxsAnalyzer ToxxAnalyzer Weiteres Zubehör Basisgerät Pipettierkopf (Head R 96/250) Peltherm (mit 5 Temperiereinheiten) Schlauchpumpenmodul Weiteres Zubehör Doppelreservoir Spitzenwaschstation (96-well) Tip-Halter Externer Pipettenspitzen-Umsetzer Temperieradapter (Optionale Ausstattungskomponeneten/-varianten)

ToxxsAnalyzer Pipettierkopf R96/250 Je nach Belegung bis zu 96 Well parallel pipettierbar Volumenbereich: 5-250 µL Plattenformate: 96-well, 384-well Material, das direkt mit zu bearbeitenden Substanzen in Berührung kommt Pipettenspitzen PP Kolbendichtung PE-HD (Polyethylen high density): Kontakt durch Aerosolbildung Keine ausreichende Resistenz u. a. gegenüber Fluorwasserstoffsäure (HF/Flusssäure) Hoch konzentrierte Säuren Reinigungspulver Farbverdünner Naphta Benzin Aceton Reinigungsspray Ozon Oxidativ wirkende Lösungen

FADU-Assay - Prinzip

FADU-Assay - Ablauf

FADU-Assay – Ablauf Position 1 Position 2 Position 3 Position 4 Plate 96 black µClear FADU plate 1 Position 1 Position 2 Position 3 Void Plate 96 black µClear FADU plate 2 Plate 96 Deep Well Cells Tips T-value Plate 96 Waste Plate Position 4 Position 5 Position 6 Deck A Plate 384 Deep Well L4, L5 Position 7 Position 8 Position 9 Wash Station Double Reservoir L1, L3 Tips P-value Tips all 96 Plates Preparation: L4,L5 Run: L2 Position 10 Position 11 Position 12 Deck C Deck B Deck positions on the ToxxsAnalyzer for the FADU-Assay

FADU-Assay - Proben Zellkulturversuche 3-D-Hautmodelle Probandenproben Zellkultivierung, Zellbehandlung (Inkubation mit Testsubstanzen, Nanopartikel), Messung Messung von extern generierten Proben evtl. mit vorgeschalteter Bestimmung der einzusetzenden Zellzahl 3-D-Hautmodelle Behandlung, Isolierung der Keratinocyten nach speziellem Protokoll und Messung im FADU Probandenproben Isolierung von PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell ‚ mononukleäre Zellen des peripheren Blutes‘) aus Blut von Probanden aus unterschiedlichsten Studien Achtung: Das Einfrieren und Auftauen isolierter Zellen oder Zellen aus Kulturen muss nach speziellen Protokollen erfolgen!

FADU-Assay – Ergebnisse (beispielhaft) Plattenbelegung 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A Ohne Zellen T-Wert P0-Wert Vehikel DMSO Vehikel H2O Etoposid C1 Etoposid C2 Etoposid C3 Etoposid C4 Etoposid C5 Mannitol B C D E F G H Etoposid: Topoisomerase-II-Inhibitor; Positiv- Kontrolle Mannitol: Negativ-Kontrolle Jurkat: Immortalisierte T-Lymphozyten

FADU-Assay – Ergebnisse (beispielhaft) MMS: fügt Methylgruppen in die DNA ein Camptothecin: Topoisomerase-I- Inhibitor Ergebnisse vergleichbar mit den Literaturergebnissen (Altex 28, 4/11)

FADU-Assay – Ergebnisse (beispielhaft) Einsatzkonzentrationen abhängig von zytotoxischen Daten nach 24 h (IC50) 3 unabhängige Wiederholungen Jeweils n=6 Inkubationszeit: 30 min, 24 h Ergebnis der Positivkontrolle: Gestelltes Zellsystem (L5178Y) geeignet Unterschiede hinsichtlich genotoxischer Eigenschaften klar erkennbar

FADU-Assay Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Fragen offen geblieben?