HbA1c- Vergleiche zwischen Zentren: wie vergleichbar sind die Ergebnisse? Anwendertreffen DPV-Pädiatrie 2004 Mainz HR HENRICHS

HbA1c – wofür ? Monitoring der Langzeit-Glykämie Index der mittleren Glykämie Mass für das Risiko der Schadensentwicklung im Dienst von Qualitätssicherungsprogrammen (Care) – Zielwertdefinition (DCCT-traceable)

DCCT Klinikbesuche HbA1c – Bestimmungen Augen-Hintergrund-Fotos 3 459Nervenleitgeschwindigkeit psychologische Tests 44742Nierenfunktionsanalysen Blutzucker-Tagesprofile (7x)

United Kingdom Prospective Diabetes Study „epidemiologische“ Auswertung pro 1% HbA1c -Senkung sinkt: die diabetesbezogene Sterblichkeit um 25 % die diabetesbezogenen Endpunkte um 21% die Herzinfarktrate um 18% die Schlaganfallrate um 15 % die Mikroangiopathien um 35%

das Problem: HbA1c die Erwartungen die Realität die Gründe (fürs Dilemma) Lösungswege

die (hohen)Erwartungen Verläßlichkeit - hier besonders !! –Richtigkeit –Stabilität + Präzision über die Zeit –Vergleichbarkeit „Geschwindigkeit“ (schnelle Befunde) als „Selbsttest“ ? weitere Wünsche – Diff.Parameter (Glyk-Q...)

Metaanalyse CSII 0.44%

Boultons Düsseldorf-Postulate ( ) Unterschiede von 0.35 – 0.5 % sollten signifikant sein Interassay- Varianz (VK/CV) = 2% klare und für Arzt und Pat. gleiche Bedeutung Vergleichbarkeit über lange Zeiträume (z.B. mit DCCT-Werte)

HbA1c - Realität mehr Probleme als... –Methodenvielfalt –mangelnde Spezifität –inkorrekte Kalibrierung –VK in Serie – wechselnd / unbefriedigend –VK im Verlauf – inkonstant –Vergleichbarkeit zwischen Praxen/Zentren - unsicher –Zahl der Methoden – unverändert hoch –spezifische Störanfälligkeit – biol/analytisch

HbA1c – Qualitätskontrolle HPLC DZQ/CKQ 1998 Zeitraum VK Sollwert 11.6 %

ERL – educational programme Teilnehmer: 26 europäische Laboratorien Methoden: 14 verschiedene. Proben: 24 zu je 5 Analysen/Quartal inclusive 4 Proben mit Störfaktoradditiven (Carbamyliert, Hb AC, Hb EE, Hb AS)

ERL – Methoden Biorad Diamat, Variant, Mon-S, Menarini 8140, Menarini 8121, Merck Hitachi, TOSOH Roche Tina Quant DCA 2000 Variant Affinity Primus Imx Cap. Electrophorese unbekannt

ERL - Parameter Abweichung vom Ziel –DCCT National Glycohemoglobin Standardisation Program (NGSP) –IFCC IFCC Working Group on Glycohemoglobin (IWG) Reproduzierbarkeit (Präzision VK) /Jahr [CV] Analysen-Linearität VK - delta [CV- ∆] Interferenzen mit carbam. Hb, Hb AC, Hb EE, HbAS

Proben

ERL –educational programme INTERPRETATION Parameterexzellentakzeptabelschwachungenügend Abweichung vom target * < 0.3% %0.6 –1.0%> 1.0% Reproduzier- barkeit (Präzision) < 2.0%2.0 – 3.4%3.5 – 5.0%> 5.0% analytische Linearität CV delta < 5% CV delta 5-9.9% CV delta 10-15% CV delta > 15% Interferenzen – Varianten < 0.3% 0.3 – 0.5% varianten entdeckt 0.6 – 1.0%> 1.0% * IFCC und/oder DCCT

ERL –educational programme ERGEBNISSE Parameterexzellentakzeptabelschwachungenügend ∆ - DCCT21983 ∆ - IFCC (Präzision) analytische Linearität carbamyliertes Hb76420 Hb AC19925 Hb EE Hb AS161044

ERGEBNISSE Parameterexzellentakzeptabelschwachungenügend ∆ - DCCT ∆ - IFCC (Präzision) analytische Linearität carbamyliertes Hb Hb AC Hb EE Hb AS DZQ

HbA1c-Vertraunsbereiche in Abhängigkeit vom Variationskoeffizienten (VK ) VK (%) 2 SD min (-2SD) max (+2SD) DZQ/CKQ „Midema“ ADA ´ instant eV. (X,97) FRANCE NQCS %

HbA1c Gründe für Unbehagen / Klagen / Ungenauigkeit / Inkonstanz / Fehler / Unvergleichlichkeit / Unschärfe : Probleme

HbA1c (AIC) – Problem-Lokalisation Präanalytik Analytik Postanalytik

Präanalytik

HbA1c - Präanalytik Untersuchnungsmaterial kapillar < venöses Blut –EDTA-Blut –Heparin-Blut –(Trägerfixiert)

HbA1c - Präanalytik Lagerung –in vitro-Glykierung –Glutathion-Addukte Transport

HbA1c - Präanalytik biologische Variable –Tageszeit der Probennahme –Körperlage –Stauung –venöse, kapillär

„Biological Variation of Glycated Hemoglobin“ ES Kilpatrik PW Maylor BG Keevil Diabetes Care 21:

Störfaktoren (1) Erythrozyten-HWZ –hämolytische Anämien –Sichel-Zell-A. –Nephropathie

Störfaktoren (2) Hämoglobin-Varianten: Hb-S (ß 6 glu ´val) Hb-C (ß6 glu ´lys) Hb-E (ß26 ´glulys) Hb-F (ß-Kette durch φ-Kette ersetzt) falsch positiv und/oder negative Werte

Störfaktoren (3) Hämoglobin-Derivate Carbamyliertes Hb (Harnstoff (0.06%pro mmol/L Harnstoff) [0.4% in nicht urämischen bis 3% bei urämischen Pat.] azetyliertes Hb (Aspirin -in vivo ?) Ascorbinated Hb (unerheblich bis 1.5g/d über 3 monate)

Störfaktoren (4) die labile Fraktion (Schiff Base – Adimin)

Analytik

Methoden-Baum von Cas Weijkamp

HbA1c-Analysenmethoden (1) basierend auf der unterschiedlichen elektrischen Ladung –Einmalsäulentrennung –HPLC-Trennung –Eletrophorese-Trennung –isoelektrische Fokussierung

HbA1c-Analysenmethoden (2) basierend auf spezifischer Bindung: Affinitätschromatographie (Borat- Aff.) –Einmalsäulentrennung –IMX Abbott) –Primus-HPLC

HbA1c-Analysenmethoden (3) basierend auf spezifischer Bindung. immunologische Methoden –Immunoturbidimetrie (BM) (tetrapeptid) –DCA-2000 (LatexImmunagglutination) –DAKO Enzym-Immunoassay (octapeptid) –Tina-quant Latex competitive Immunoturbidimetrie

HbA1c-Analysenmethoden (4) chemische Methoden –Thiobarbitursäure - Kolorimetrie

Anforderungen für die Routine HbA1c – Bestimmungs-Analyse evaluierte und akzeptierte Methode (Goldstandard) oder in Referenz zu etablierten Methoden (Zu-)Verläßlichkeit –sicherheit für die Routine –Reproduzierbarkeit / Stabilität Kenntnis über die Methode, ihren Normbereich, Störungen, Interferenzen, Kinetik, Interaktionen Geschwindigkeit Zeitkonstanz bekannte Basis-Statistik

Die Summe der Probleme nährt Konfusion

pragmatische Ansätze lebendige Reihe Doppel- oder Kontroll-Untersuchungen (2 Methoden) Probentausch unter Zentren Normwert oder – Bereichkalkulationen (ASD..)

1. eine verbindliche Methode für alle 6 Vorschläge

2. eine verbindliche Referenzmethode

3. eine absolute Bestimmungsmethode Abtrennung der gebundenen N- terminalen Valin-Glukose

4. Referenzsubstanz (isoliert oder synthetisiert) (Primärstandard)

5. willkürliche Kalibrierung gefrorene oder lyophilisierte Kalibratoren z.B. Goldsteins DCCT-Standard

6. Angabe in entsprechenden Blutglukosekonzentrationen - mittlere Glukosekonzentration

mittlere Relation zwischen Blutzucker und HbA1c HbA1c = 2.07 x MBG (* MBG = 33.3 HbA1c – 86 (** (* Svensen et al. Diabetologia 1982 (** Nathan et al N Engl J Med 1984 acc FJ Service 1988

Der Ausweg: systematische Standardisierung

Standardisierung – „alt“ 1996 AACC + ADA + CDC = NGSP (National Glycohemoglobin Standardisation Program)  HPLC DCCT Bio-Rex 70) =designed comparison method (DCM)  (ca. 97% aller US-Labs)

Standardisierung –“neu“ IFCC : „true HbA1c“

IFCC Referenzsystem „true HbA1c“ 1.Definition des Analyten 1.Hb, das am N-Terminus seiner ß-Kette glykiert it 2.primäre Referenzmaterialien 1.Herstellung von reinem HbA1c und HbAo – Referenzkalibratoren 3.Referenzmethode 1.enzymatische Peptidspaltung – 1.A) HPLC/Electrospray Massenspektrometrie 2.b) HPLC/Kapillarelektrophorese

IFCC - Referenzmethoden Hämolysat Enzymatische Spaltung HPLC / Kapillarelektrophorese HPLC / Massenspektrometrie

IFCC Netzwerk von HbA1c- Referenzlaboratorien Europa, USA, Japan Ringversuche Interlaboratoriums-% CV <1.5 sekundäre Referenzmaterialien, Kalibratoren und Richtigkeitskontrollproben

„Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human blood“ Jeppsson JO,U Kobold, J Barr, A Finke, W Hoezel, t Hoshino et al Clin Chem Lab Med 40:

Die IFCC „numbers“ sind signifikant niedriger als die aktuellen DCCT/NGSP Werte der vorläufige neue Norm-Bereich reicht bis 3.8% anstelle des derzeitigen 5.7 oder 6.0%

Vereinbarungen von nationalen und/oder internationalen Gesellschaften sind erforderlich lineare Beziehungen bestehen

z.B. „Masterequation“ %HbA1c (DCCT/NGSP) = %HbA1c(IFCC) x

1998 Richtlinie 98/79/EG des europäischen Parlaments und des Rates vom über in-vitro Diagnostica Die IVD Direktive fordert die Traceability der Standardisierung für in vitro-Diagnostika. Die Standardisierung muß auf dem Referenzsystem der höchsten metrological Ordnung, das für diesen Parameter existiert, basieren

aktuelle Standardisierungsdiskussion (roadmap) ADA + IDF + EASD Düsseldorf Sept Paris London

Klärungsbedarf: 3 Optionen 1.switch alle Resultate auf die neue Methode 2.switch die „gold standard“ Methode von der HPLC auf die neue MS-basierten Tests, aber transform die Werte nach einer zuverlässigen „master equation“, zur Beibehaltung der gewohnten „Zahlen“ 3.behalte die derzeitigen Methoden, denn alle sind nur Näherungen zur „Wahrheit“

HbA1c = GHb = AIC (Mittelblutzucker ?)