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Event-Specific Detection of Seven Genetically Modified Soybean and Maizes Using Multiplex- PCR Coupled with Olignucleotide Microarray © ETH Zürich Jia.

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Präsentation zum Thema: "Event-Specific Detection of Seven Genetically Modified Soybean and Maizes Using Multiplex- PCR Coupled with Olignucleotide Microarray © ETH Zürich Jia."—  Präsentation transkript:

1 Event-Specific Detection of Seven Genetically Modified Soybean and Maizes Using Multiplex- PCR Coupled with Olignucleotide Microarray © ETH Zürich Jia Xu, Shuifang Zhu, Haizhen Miao, Wensheng Huang, Minyan Qiu, Yan Huang, Xuping Fu and Yao Li (China, 2007)

2 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Überblick Ziel des Papers Einleitung Material & Methoden Resultate Diskussion Qualität des Papers

3 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Ziel des Papers Eine neue Methode zur Identifikation von unterschiedlichen GMO Ereignissen, basierend auf der einzigen und spezifischen Integrations- Junction - Sequenz zwischen dem DNA Genom der Wirtpflanze und dem integriertem Gen, zu entwickeln. Mittels Multiplex-PCR & einem Oligonukleotid Mikroarray

4 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Einleitung Seit 1996 bis 2006 ist der GM Getreideanbau um das 60-fache weltweit angestiegen (vor allem in Entwicklungsländer) GM Sojabohnen ->58.6 Mio. Hektaren GTS Herbizid tolerante Sojabohne GM Mais -> 25.3 Mio. Hektaren MON 810 Herbizid toleranter Mais Aufgrund der Lebensmittelsicherheit, Umweltrisiken und ethischen Gründen, wurden GMO Labeling Vorschriften aufgestellt, zum Schutz des Konsumenten. -> Labeling- Grenzwerte: - EU 0.9% ; Korea 3%; Japan 5%

5 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Multiplex-PCR In der Multiplex-PCR Methode wird mehr als ein Primerpärchen verwendet. Das Ziel einer Multiplex-PCR ist, mehrere Segmente der Ziel DNA gleichzeitig zu amplifizieren. Diese PCR Methode ermöglicht eine Amplifikation von mehreren DNA Zielen in einem Schritt

6 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Oligonucleotid - Mikroarray

7 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Material & Methoden Materialien GM Sojabohne (GTS ) GM Mais (MON810, MON863, Bt176, Bt11, GA21, T25) DNA Extraktion Mittels CTAB Methode Herstellung passender Primer & Sonden Primer und Sonden müssen der spezifischen Integrations-Junction- Sequenz entsprechen Primer müssen bestimmte Bedienungen erfüllen: -Fähig sein degradierte genmoische DNA zu analysieren -Schmelzpunkt zwischen 55 und 60°C -Kompatibilität mit der PCR-Mischung

8 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Konstruktion von Oligonukleotid -Mikroarrays Figure 1 Oligonucleotide microarray format. The red spots mean positive control. The black ones mean probes of the special junction site sequences. The blue ones mean probes of some ordinary promoter and terminator and positive control. The green ones mean blank control.

9 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Material & Methoden PCR & Markierung Amplifizierung und Markierung der Zielgene in einem Multiplex-PCR System Direkte Sequenzierungs-Analyse der PCR-Produkte Die PCR-Produkte wurden mit einem PCR-Produkt-Aufreinigungs Kit aufgereinigt. Alle PCR-Produkte wurden direkt sequenziert mittels eines DNA- Sequenzer, um die Gültigkeit dieser amplifizierten PCR-Produkte zu bestärken. Hybridisierung & Signal Detektion

10 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Verwendete Proben Zu testeten Proben Kontroll-Proben Blank von Nukleotiden (Wasserkontrolle) Positive Qualitätskontrolle (bekannte GMO Proben) Negative Qualitätskontrolle (konventionelle Proben)

11 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Resultate Abbildung der Mikroarray- Hybridisierung

12 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Resultate Bestimmung von positive und negative Ergebnisse Positive bzw. negative Ergebnisse beruhen auf der Erscheinung von Fluoreszenzsignalen von markierten Proben Die durchschnittliche Signalintensität von den negativen Qualitätskontrollproben wurde als Hintergrundsignalintensität verwendet Das Verhältnis zwischen der Signalintensität von den markierten Sequenzproben und den negativen Kontrollproben wurde berechnet Mehrere Experimente wurde mit bekannte positive und negative Proben durchgeführt. Ein Verhältnis von 5:1 wurde als Grenze für die positiven Resultate gesetzt.

13 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Ein Verhältnis von 3.5:1 wurde als Grenze für negative Resultate gesetzt. Eine Probe wurde als positiv betrachtet, wenn der Durchschnitt über 5 war und als negativ wenn er unter 3.5 war. Jedes Experiment wurde 3 mal durchgeführt

14 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Resultate Optimierung und Auswertung der Methode Das System besteht aus zwei Schritten: -Multiplex- PCR -Hybridisierung Die markierte Sequenz wurde amplifiziert Die Intensität des Fluoreszenzsignals wurde bestimmt Es ist wichtig alle Reaktionsschritte zu optimieren, um die Richtigkeit des Detektionsystem sicher zu stellen.

15 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Diskussion PCR ist die am meisten verwendete Technik für GMO Detektion Problem: Es ist schwer PCR-Produkte mit konventionelle Methoden zu untersuchen, wenn mehrere Fragmente gleichzeitig amplifiziert werden müssen. Problemlösung: Oligonukleotid- Mikroarray Technologie - schnell, zuverlässig und empfindlich -

16 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH Qualität des Papers Zusammenhang schwer ersichtlich Zu wenig Bilder und Kommentare Tabellen/ Abbildungen zum Teil mangelhaft erklärt Interessante und wichtige Methode

17 Datum: 13. November 2007 Diane von Richthofen & Sylvia Pruksa/ETH


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