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Bestimmung von HbA1c im Blut INSTAND e.V. Referenzlabor Dr. Patricia Kaiser Universität Szeged Medizinische Fakultät 2009.

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1 Bestimmung von HbA1c im Blut INSTAND e.V. Referenzlabor Dr. Patricia Kaiser Universität Szeged Medizinische Fakultät 2009

2 HbA1c INSTAND e. V. Bedeutender Parameter im eine glykierte Form des Hämoglobins spiegelt die mittlere Blutzuckerlage des letzten 4-6 Wochen wider Therapieüberwachung Indikator für Therapieerfolg von Patient und Diabetesklinik Qualitätsmanagement des Diabetes Medizinische Analytik SS 2009

3 Hämoglobin INSTAND e. V. Medizinische Analytik SS 2009

4 INSTAND e. V. Amadori - Umlagerung Medizinische Analytik SS 2009

5 HbA0 Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – HbA1c Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – Gluc – ß-Kette des Hämoglobins INSTAND e. V. Medizinische Analytik SS 2009

6 INSTAND e. V. Analyseverfahren für die glykierten Hämoglobine VerfahrenPrinziperfasste FraktionenMarkenname SäulenchromatographieIonenaustausch-HbA 1a, HbA 1b (Makrosäule)chromatographieHbA 1c MikrosäuleIonenaustausch-HbA 1 chromatographie HPLCIonenaustausch-HbA 1a, HbA 1b,Variant II, Diamat chromatographieHbA 1c HA8160, L-9100 FPLCIonenaustausch-HbA 1a, HbA 1b, chromatographieHbA 1c, Aldimin-Form AffinitätschromatogrphiePhenylboratsäuleGesamt-GlykoGHb, IMx II hämoglobin Immunologischez.B. Immun-HbA 1c TinaQuant VerfahrenturbidimetrieHA 1c Dimension ReferenzmethodeHPLC-ESI-MSHbA 1c bzw. HPLC-CE Medizinische Analytik SS 2009

7 HbA1c Routine-Methoden INSTAND e. V. Medizinische Analytik SS 2009

8 HbA1cMicrosäulenmethode INSTAND e. V. In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Testprinzip: Herstellung eines Hämolysats aus der Blutprobe Auftragen des Hämolysats auf Ionenaustauschersäule Elution der HbA1c-Fraktion Quantifizierung der HbA1c-Fraktion mittels Photometer bei 415 nm Medizinische Analytik SS 2009

9 HbA1cMicrosäulenmethode INSTAND e. V. In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Medizinische Analytik SS 2009

10 HbA1cMicrosäulenmethode INSTAND e. V. In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Medizinische Analytik SS 2009

11 HbA1cMicrosäulenmethode INSTAND e. V. In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Diagnostische Bedeutung: HbA1c spiegelt die mittlere Blutzucker-Konzentration der letzten 6-8 Wochen wider und ist hiermit wertvoll für die Verlaufskontrolle von Patienten mit Diabetes Mellitus. Die HbA1c-Konzentration kann nach folgender Formel in die mittlere Blutglucose Konzentration (MBG) umgerechnet werden: MBG (mg/dL)= 31,7 x %HbA1c – 66,1 MBG (mmol/L) = 1,76 x %HbA1c – 3,67 Medizinische Analytik SS 2009

12 HbA1cMicrosäulenmethode INSTAND e. V. In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Referenzbereiche:NGSPIFCCMicrosäule (Biocon) Stoffwechselgesunde4.0 – 6.0 %2.0 – 4.2 %4.4 – 6.7 % Diab. Zieleinstellung6.0 – 6.5 %4.2 – 4.8 %6.7 – 7.3 % Überwachungsbereich6.5 – 8.0 %4.8 – 6.4 %7.3 – 9.1 % Therapiebedarf> 8 %> 6.4 %> 9.1 % Für diagnostische Zwecke sind die HbA1c-Ergebnisse stets im Zusammenhang mit der Anamnese, der klinischen Untersuchung und anderen Untersuchungsergebnissen zu werten. Medizinische Analytik SS 2009

13 Einführung in die HPLC-MS Analytik

14 HPLC:High Pressure Liquid Chromatography = chromatographisches Trennverfahren MS:Mass Spectrometry = analytisches Detektionsverfahren HPLC-MS Die HPLC-MS Technik ist ein Messverfahren, dass in den letzten Jahren in der Medizinischen Analytik zunehmend an Bedeutung gewonnen hat. Im Bereich der Laboratoriumsmedizin ermöglicht es mit höchster Präzision und Richtigkeit die Bestimmung von endogenen und exogenen Substanzen z.B aus Blut oder Urin. Durch seine gute Automatisierbarkeit wird es besonders bei hohem Probenaufkommen ( high throughput) für die Therapieüberwachung (therapeutic drug monitoring) und z.B. für das Neugeborenen-Screening in Routinelabors eingesetzt. Medizinische Analytik SS 2009

15 Farben schreiben oder zeichnen (griech.) auf Filterpapier : Papierchromatographie auf Kieselgel- beschichteten Glas:Dünnschichtchromatographie über mit Kieselgel-gefüllte Säulen:Säulenchromatographie Chromatographie Medizinische Analytik SS 2009

16 Blattfarbstoffe in Lösung – 1. Grüne Blätter werden im Mörser zerrieben und danach in Alkohol aufgelöst – grüne Lösung 2. Grüne Lösung wird in eine Säule (gefüllt mit feinem Seesand) oder auf ein rundes Kreidestück gegeben 3. Einzelne Farbanteile verlassen wieder die Säule getrennt : gelbe, gelbgrüne, grüne, blaugrüne Chromatographie Ein einfacher Versuch zur Darstellung des Prinzips der chromatographischen Säulen-Trennung: Medizinische Analytik SS 2009

17 Detektion: z.B.UV-, Fluoreszenz-, ECD-, oder MS- Detektor Chromatographie Signal = Peak Medizinische Analytik SS 2009

18 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie HPLC = High Pressure Liquid Chromatography Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

19 Lösungsmittelflaschen Pumpen Probeninjektor Detektor Säule / Säulenofen Abfall Entgaser Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

20 Schritt 1: Lösungsmittel wird von den Pumpen angesaugt (blaue und orange Linien) und zum Mischer gepumpt. Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

21 Schritt 2: Gemisch wird zum Probengeber gepumpt (Ventil) Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

22 Schritt 3: Probenschleife wird mit Lösungsmittelgemisch gefüllt Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu Medizinische Analytik SS 2009

23 Schritt 4 a: Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet) Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

24 Schritt 4b: Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet) Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

25 Schritt 5: Probe wird zur Säule transportiert Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

26 Schritt 6: Probenbestandteile verlassen die Säule nacheinander und werden im Detektor angezeigt Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

27 Massenspektrometrie Mit Hilfe der Massenspektrometrie ist es möglicht, Komponenten in komplexen Mischungen zu identifizienen und quantifizieren. Zu diesem Zweck werden die Analyte ionisiert in die Gasphase überführt und nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) sortiert detektiert. Medizinische Analytik SS 2009

28 IonenquelleMassenanalysator GC/MS: EI, CIQuadrupole LC/MS: ESI, APCI, APPIIon trap Biomolecules: MALDITime of Flight Triple Quadrupole Aufbau eines Massenspektrometers Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

29 Triple Quadrupole System Ion detectionIon filteringIon transport Ion production Ion filteringFragmentation Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

30 Triple Quadrupole System Ion production Schritt 1:Ionen-Erzeugung im ESI-Interface Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

31 Electrospray Ionization (ESI) Verbindet HPLC mit MS: Überführung des Analyten flüssig gasförmig Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

32 Ion transport Schritt 2:Ionen-Transport vom ESI-Interface ins MS Triple Quadrupole System Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

33 Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

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83 Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

84 Triple Quadrupole System Selected Ion Monitoring (SIM) Filter ionsScan ions Quadrupole full scan Verschiedene Scan-Verfahren (Modi) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

85 Triple Quadrupole System Selected Ion Monitoring (SIM) Quantifizierung einer bekannten Komponente über das Molekül-Ion und Frakmentierung Identifizierung von unbekannten Komponenten (Information über Molekular-Gewicht) Quadrupole full scan Beispiel-Chromatogramme Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

86 Fragmentation Triple Quadrupole System Schritt 4:Frakmentierung des Analyten (precursor ion) zu substanzspezifischen Bruchstücken (product ions) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

87 Triple Quadrupole System Ion filtering Schritt 5:Ionen-Filter nach Frakmentierung Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

88 Ion detection Triple Quadrupole System Schritt 6:Detektion der heraus gefilterten Ionen Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

89 INSTAND e. V. Qualitätsmanagement des Diabetes Referenzmethode nach IFCC DCCT-Studie DCCT D iabetes C ontrol and C omplication T rial Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein NGSP N ational G lycohemoglobin S tandardization P rogram DCCT-Studie Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit

90 NGSP Kalibration nach Goldstein et al. HPLC Methode mit Kationenaustauscher- Säule (BioRex 70) keine Trennung von HbA 1c, HbF und carbamylierten Hämoglobinen Interferenz von HbA 0 mit glykierten Hämoglobinen Interferenzen mit abnormen Hämoglobinen 2.1 % Bias (abs.) Medizinische Analytik SS 2009

91 INSTAND e. V. Qualitätsmanagement des Diabetes Referenzmethode nach IFCC Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit DCCT-Studie DCCT D iabetes C ontrol and C omplication T rial Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein NGSP N ational G lycohemoglobin S tandardization P rogram DCCT-Studie Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein Referenzmethode nach IFCC Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit

92 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 2. Proteolyse des Hämolysats 3. HPLC-ESI-MS-Analyse Meßprinzip: Bestimmung der Ratio des glykierten zum nicht-glykierten ß-N- terminalen Hexapeptids vom Hämoglobin Referenzmethode Bestimmung von HbA1c im Blut mittels HPLC-ESI-MS nach IFCC INSTAND e. V. 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 2. Proteolyse des Hämolysats 1. Hämolyse der Vollblut-Probe

93 Proteolyse des Hämolysats HbA0 Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – HbA1c Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – Gluc – INSTAND e. V. Glu – Lys – Glu-C

94 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 2. Proteolyse des Hämolysats 3. HPLC-ESI-MS-Analyse Meßprinzip: Bestimmung der Ratio des glykierten zum nicht-glykierten ß-N- terminalen Hexapeptids vom Hämoglobin Referenzmethode Bestimmung von HbA1c im Blut mittels HPLC-ESI-MS nach IFCC INSTAND e. V. 3. HPLC-ESI-MS-Analyse

95 HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC (Shimadzu) Pumpe A Pumpe B Mischkammer Autosampler Säulenoven Degasser Schaltventil Controller MS (Applied Biosystems) API 4000Triplequadrupol Massenspektrometer ESI-Quelle:TurboV TM source mit TurboIon Spray TM probe Software:Analyst TM INSTAND e. V. Medizinische Analytik SS 2009

96 HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC-Bedingungen: Zorbax SB-CN, 5 µ 2.1 mm x 150 mm50 °C, 2 µl Eluent A:0.025 % TFA in Wasser Eluent B:0.023 % TFA in Acetonitril Gradient:300 µl/min Scan type:Q1 Multiple Ions Masse:348.3 amu (nicht-glykiertes Hexapeptid) amu (glykiertes Hexapeptid) Dwell time:1 s Temperatur:500 °C MS-Bedingungen: INSTAND e. V. Zeit [min] % B stop Medizinische Analytik SS 2009

97 HPLC-ESI-MS-Analyse INSTAND e. V. ß-N-terminales Hexapeptid von HbA 1c m/z 429 amu ß-N-terminales Hexapeptid von HbA 0 m/z 348 amu LC-ESI-MS Chromatogramm einer Hämolysat-Probe

98 Referenzmethoden Rückführbarkeit auf primären StandardRückführbarkeit auf primären Standard -SI Einheiten -definierte Reinheit -definierte Messunsicherheit Vergleichbarkeit auf internationaler EbeneVergleichbarkeit auf internationaler Ebene -Netzwerk (JCTLM, IFCC HbA 1c ) Medizinische Analytik SS 2009

99 HPLC-ESI-MS-Analyse INSTAND e. V. HbA 1c Kalibrationskurve nach IFCC Medizinische Analytik SS 2009

100 INSTAND e. V. Internationale Vergleichsmessung der IFCC Working Group on HbA1c Standardisation Medizinische Analytik SS 2009

101 Internationale Vergleichsmessung der IFCC Working Group on HbA1c Standardisation Medizinische Analytik SS 2009

102 sample B [%] sample A [%] HbA1c INSTAND e. V. Ringversuch 2005 HbA 1c INSTAND e. V. Probe Zielwert [µg/L] VK [%] Bewertungs- grenzen [µg/L] Mittelwert [µg/L] VK [%] Bestehensquote [%] A B ReferenzmethodeRoutinemethoden

103 HbA1c Messergebnisse nach IFCC Referenzmethode und NGSP-Goldstein INSTAND e. V. IFCC (%HbA1c) NGSP (%HbA1c) NGSP = (0.915 * IFCC) Medizinische Analytik SS 2009

104 INSTAND e. V. HbA 1c Einheit NGSP% NGSP abgeleitet:% IFCC abgeleitet: ab 2009 mmol/mol Darstellung von HbA1c - Werten bis 2008 % Medizinische Analytik SS 2009

105 INSTAND e. V. Umrechnung [%] NGSP Werte [%] in IFCC Werte [mmol/mol] [%] IFCC [mmol/mol] = (NGSP [%] ) / Master Equation Medizinische Analytik SS 2009

106 INSTAND e. V. HbA 1c NGSP [%]HbA 1c IFCC [mmol/mol] new Referenz-Bereich: 4.0 – 6.0 %20 – 42 mmol/mol Darstellung von HbA1c - Werten Medizinische Analytik SS 2009

107 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit INSTAND e. V.

108 ß-Kette von verschiedenen Hämoglobinen (N-Term. AA 1-9) Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser HbA Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbS Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbC Gly-His-Phe-Thr-Glu-Glu-Asp-Lys-Ala HbF AA

109 INSTAND e. V.

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