Universität Szeged Medizinische Fakultät 2009

Präsentation zum Thema: "Universität Szeged Medizinische Fakultät 2009"—  Präsentation transkript:

1 Universität Szeged Medizinische Fakultät 2009
Bestimmung von HbA1c im Blut INSTAND e.V. Referenzlabor Dr. Patricia Kaiser

2 Qualitätsmanagement des Diabetes
INSTAND e. V. HbA1c Bedeutender Parameter im eine glykierte Form des Hämoglobins spiegelt die mittlere Blutzuckerlage des letzten 4-6 Wochen wider Therapieüberwachung Indikator für Therapieerfolg von Patient und Diabetesklinik Qualitätsmanagement des Diabetes Medizinische Analytik SS 2009

3 INSTAND e. V. Hämoglobin Medizinische Analytik SS 2009

4 INSTAND e. V. Amadori - Umlagerung Medizinische Analytik SS 2009

5 ß-Kette des Hämoglobins
INSTAND e. V. ß-Kette des Hämoglobins HbA Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – HbA1c Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – Gluc – Medizinische Analytik SS 2009

6 Analyseverfahren für die glykierten Hämoglobine
INSTAND e. V. Analyseverfahren für die glykierten Hämoglobine Verfahren Prinzip erfasste Fraktionen Markenname Säulenchromatographie Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b (Makrosäule) chromatographie HbA1c Mikrosäule Ionenaustausch- HbA1 chromatographie HPLC Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b, Variant II, Diamat chromatographie HbA1c HA8160, L-9100 FPLC Ionenaustausch- HbA1a, HbA1b, chromatographie HbA1c, Aldimin-Form Affinitätschromatogrphie Phenylboratsäule Gesamt-Glyko GHb, IMx II hämoglobin Immunologische z.B. Immun- HbA1c TinaQuant Verfahren turbidimetrie HA1c Dimension Referenzmethode HPLC-ESI-MS HbA1c bzw. HPLC-CE Medizinische Analytik SS 2009

7 HbA1c Routine-Methoden
INSTAND e. V. Medizinische Analytik SS 2009

8 In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut
INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Testprinzip: Herstellung eines Hämolysats aus der Blutprobe Auftragen des Hämolysats auf Ionenaustauschersäule Elution der HbA1c-Fraktion Quantifizierung der HbA1c-Fraktion mittels Photometer bei 415 nm Medizinische Analytik SS 2009

9 In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut
INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Medizinische Analytik SS 2009

10 In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut
INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Medizinische Analytik SS 2009

11 In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut
INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Diagnostische Bedeutung: HbA1c spiegelt die mittlere Blutzucker-Konzentration der letzten 6-8 Wochen wider und ist hiermit wertvoll für die Verlaufskontrolle von Patienten mit Diabetes Mellitus. Die HbA1c-Konzentration kann nach folgender Formel in die mittlere Blutglucose Konzentration (MBG) umgerechnet werden: MBG (mg/dL) = 31,7 x %HbA1c – 66,1 MBG (mmol/L) = 1,76 x %HbA1c – 3,67 Medizinische Analytik SS 2009

12 In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut
INSTAND e. V. HbA1c Microsäulenmethode In vitro Test für die Bestimmung von HbA1c in Blut Referenzbereiche: NGSP IFCC Microsäule (Biocon) Stoffwechselgesunde 4.0 – 6.0 % 2.0 – 4.2 % 4.4 – 6.7 % Diab. Zieleinstellung 6.0 – 6.5 % 4.2 – 4.8 % 6.7 – 7.3 % Überwachungsbereich 6.5 – 8.0 % 4.8 – 6.4 % 7.3 – 9.1 % Therapiebedarf > 8 % > 6.4 % > 9.1 % Für diagnostische Zwecke sind die HbA1c-Ergebnisse stets im Zusammenhang mit der Anamnese, der klinischen Untersuchung und anderen Untersuchungsergebnissen zu werten. Medizinische Analytik SS 2009

13 Einführung in die HPLC-MS Analytik

14 HPLC: High Pressure Liquid Chromatography
HPLC-MS Die HPLC-MS Technik ist ein Messverfahren, dass in den letzten Jahren in der Medizinischen Analytik zunehmend an Bedeutung gewonnen hat. Im Bereich der Laboratoriumsmedizin ermöglicht es mit höchster Präzision und Richtigkeit die Bestimmung von endogenen und exogenen Substanzen z.B aus Blut oder Urin. Durch seine gute Automatisierbarkeit wird es besonders bei hohem Probenaufkommen ( „high throughput“) für die Therapieüberwachung (therapeutic drug monitoring) und z.B. für das Neugeborenen-Screening in Routinelabors eingesetzt. HPLC: High Pressure Liquid Chromatography = chromatographisches Trennverfahren MS: Mass Spectrometry = analytisches Detektionsverfahren Medizinische Analytik SS 2009

15 “Farben schreiben” oder “zeichnen” (griech.)
Chromatographie “Farben schreiben” oder “zeichnen” (griech.) auf Filterpapier : Papierchromatographie auf Kieselgel- beschichteten Glas: Dünnschichtchromatographie über mit Kieselgel-gefüllte Säulen: Säulenchromatographie Medizinische Analytik SS 2009

16 Chromatographie Ein einfacher Versuch zur Darstellung des Prinzips der chromatographischen Säulen-Trennung: 1. Grüne Blätter werden im Mörser zerrieben und danach in Alkohol aufgelöst – grüne Lösung 2. Grüne Lösung wird in eine Säule (gefüllt mit feinem Seesand) oder auf ein rundes Kreidestück gegeben Blattfarbstoffe in Lösung – 3. Einzelne Farbanteile verlassen wieder die Säule getrennt : gelbe, gelbgrüne, grüne, blaugrüne Medizinische Analytik SS 2009

17 z.B.UV-, Fluoreszenz-, ECD-, oder MS- Detektor
Chromatographie Detektion: z.B.UV-, Fluoreszenz-, ECD-, oder MS- Detektor Signal = „Peak“ Medizinische Analytik SS 2009

18 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
HPLC = High Pressure Liquid Chromatography Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

19 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Lösungsmittelflaschen Entgaser Pumpen Probeninjektor Detektor Säule / Säulenofen Abfall Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

20 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 1: Lösungsmittel wird von den Pumpen angesaugt (blaue und orange Linien) und zum Mischer gepumpt. Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

21 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 2: Gemisch wird zum Probengeber gepumpt (Ventil) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

22 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 3: Probenschleife wird mit Lösungsmittelgemisch gefüllt Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

23 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 4 a: Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

24 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 4b: Nach Probennahme aus dem Gläschen wird die Probe in das Lösungsmittelgemisch injiziert (Ventil schaltet) Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

25 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 5: Probe wird zur Säule transportiert Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

26 Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie
Schritt 6: Probenbestandteile verlassen die Säule nacheinander und werden im Detektor angezeigt Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Shimadzu

27 Massenspektrometrie Mit Hilfe der Massenspektrometrie ist es möglicht, Komponenten in komplexen Mischungen zu identifizienen und quantifizieren. Zu diesem Zweck werden die Analyte ionisiert in die Gasphase überführt und nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) sortiert detektiert. Medizinische Analytik SS 2009

28 Aufbau eines Massenspektrometers
Ionenquelle Massenanalysator GC/MS: EI, CI Quadrupole LC/MS: ESI, APCI, APPI Ion trap Biomolecules: MALDI Time of Flight Triple Quadrupole Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

29 Triple Quadrupole System
Ion production Ion transport Ion filtering Fragmentation Ion filtering Ion detection Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

30 Triple Quadrupole System
Schritt 1: Ionen-Erzeugung im ESI-Interface Ion production Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

31 Electrospray Ionization (ESI)
Verbindet HPLC mit MS: Überführung des Analyten flüssig → gasförmig Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

32 Triple Quadrupole System
Schritt 2: Ionen-Transport vom ESI-Interface ins MS Ion transport Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

33 Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben
+ + + - Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

34 - + + + -

35 + + - - +

36 + + + - - +

37 - + + + -

38 + - - + +

39 - + + + -

40 - + + + + -

41 + + - - +

42 + + + - - +

43 - + + + -

44 + - - + +

45 - + + + -

46 - + + + + -

47 + + - - +

48 + + + - - +

49 - + + + -

50 - + + + -

51 - + + + + -

52 + + - - +

53 + + + - - +

54 + - - + +

55 - + + + -

56 + - - + +

57 - + + + -

58 - + + + + -

59 + + - - +

60 + + + - - +

61 - + + + -

62 + - - + +

63 - + + + -

64 - + + + + -

65 + + - - +

66 + + + - - +

67 - + + + -

68 + - - + +

69 - + + + -

70 - + + + + -

71 + + - - +

72 + + + - - +

73 - + + + -

74 + - - + +

75 - + + + -

76 - + + + + -

77 + + - - +

78 + + + - - +

79 - + + + -

80 + - - + +

81 - + + + -

82 - + + + + -

83 Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben
+ + - - + Ionen-Bewegung zwischen den Quadrupol-Stäben Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

84 Triple Quadrupole System
Verschiedene Scan-Verfahren (Modi) Quadrupole full scan Selected Ion Monitoring (SIM) Scan ions Filter ions Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

85 Triple Quadrupole System
Beispiel-Chromatogramme Quadrupole full scan Selected Ion Monitoring (SIM) Identifizierung von unbekannten Komponenten (Information über Molekular-Gewicht) Quantifizierung einer bekannten Komponente über das Molekül-Ion und Frakmentierung Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

86 Triple Quadrupole System
Schritt 4: Frakmentierung des Analyten (precursor ion) zu substanzspezifischen Bruchstücken (product ions) Fragmentation Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

87 Triple Quadrupole System
Schritt 5: Ionen-Filter nach Frakmentierung Ion filtering Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

88 Triple Quadrupole System
Schritt 6: Detektion der heraus gefilterten Ionen Ion detection Medizinische Analytik SS 2009 Abb. mit freundlicher Genehmigung von Fa. Applied Biosystems

89 Qualitätsmanagement des Diabetes
INSTAND e. V. Qualitätsmanagement des Diabetes DCCT-Studie DCCT-Studie Diabetes Control and Complication Trial Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein National Glycohemoglobin Standardization Program Referenzmethode nach IFCC Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit

90 NGSP Kalibration nach Goldstein et al.
HPLC Methode mit Kationenaustauscher- Säule (BioRex 70) keine Trennung von HbA1c, HbF und carbamylierten Hämoglobinen Interferenz von HbA0 mit glykierten Hämoglobinen Interferenzen mit abnormen Hämoglobinen → 2.1 % Bias (abs.) Medizinische Analytik SS 2009

91 Qualitätsmanagement des Diabetes
INSTAND e. V. Qualitätsmanagement des Diabetes Referenzmethode nach IFCC Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit DCCT-Studie Diabetes Control and Complication Trial Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein National Glycohemoglobin Standardization Program DCCT-Studie Standardisierung der Vergleichsmessungen NGSP - Goldstein Referenzmethode nach IFCC Internationale Vergleichbarkeit auf höchster Ebene der Richtigkeit

92 INSTAND e. V. Meßprinzip: Bestimmung der Ratio des glykierten zum nicht-glykierten ß-N- terminalen Hexapeptids vom Hämoglobin Referenzmethode Bestimmung von HbA1c im Blut mittels HPLC-ESI-MS nach IFCC 2. Proteolyse des Hämolysats 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 2. Proteolyse des Hämolysats 3. HPLC-ESI-MS-Analyse

93 Proteolyse des Hämolysats
INSTAND e. V. Proteolyse des Hämolysats HbA Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – HbA1c Val – His – Leu – Thr – Pro – Glu – Glu – Lys – Gluc – Glu-C Glu – Lys – Glu – Lys –

94 1. Hämolyse der Vollblut-Probe
INSTAND e. V. Meßprinzip: Bestimmung der Ratio des glykierten zum nicht-glykierten ß-N- terminalen Hexapeptids vom Hämoglobin Referenzmethode Bestimmung von HbA1c im Blut mittels HPLC-ESI-MS nach IFCC 1. Hämolyse der Vollblut-Probe 2. Proteolyse des Hämolysats 3. HPLC-ESI-MS-Analyse 3. HPLC-ESI-MS-Analyse

95 HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC (Shimadzu) MS (Applied Biosystems) Pumpe A
INSTAND e. V. HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC (Shimadzu) Pumpe A Pumpe B Mischkammer Autosampler Säulenoven Degasser Schaltventil Controller MS (Applied Biosystems) API Triplequadrupol Massenspektrometer ESI-Quelle: TurboVTM source mit TurboIon SprayTM probe Software: AnalystTM Medizinische Analytik SS 2009

96 HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC-Bedingungen: MS-Bedingungen:
INSTAND e. V. HPLC-ESI-MS-Analyse HPLC-Bedingungen: Zorbax SB-CN, 5 µ 2.1 mm x 150 mm 50 °C, 2 µl Eluent A: % TFA in Wasser Eluent B: % TFA in Acetonitril Gradient: 300 µl/min Zeit [min] % B stop MS-Bedingungen: Scan type: Q1 Multiple Ions Masse: amu (nicht-glykiertes Hexapeptid) 429.3 amu (glykiertes Hexapeptid) Dwell time: 1 s Temperatur: 500 °C Medizinische Analytik SS 2009

97 HPLC-ESI-MS-Analyse LC-ESI-MS Chromatogramm einer Hämolysat-Probe
INSTAND e. V. HPLC-ESI-MS-Analyse LC-ESI-MS Chromatogramm einer Hämolysat-Probe ß-N-terminales Hexapeptid von HbA1c m/z 429 amu ß-N-terminales Hexapeptid von HbA0 m/z 348 amu

98 Rückführbarkeit auf primären Standard - SI Einheiten
Referenzmethoden Rückführbarkeit auf primären Standard - SI Einheiten - definierte Reinheit - definierte Messunsicherheit Vergleichbarkeit auf internationaler Ebene - Netzwerk (JCTLM, IFCC HbA1c) Medizinische Analytik SS 2009

99 HPLC-ESI-MS-Analyse HbA1c Kalibrationskurve nach IFCC INSTAND e. V.
Medizinische Analytik SS 2009

100 INSTAND e. V. Internationale Vergleichsmessung der IFCC Working Group on HbA1c Standardisation HbA1c-Referenzlabor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 HbA1c [%] 14 Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4 Probe 5 raw mean raw mean +/- 4 % Medizinische Analytik SS 2009

101 Internationale Vergleichsmessung der IFCC Working Group on HbA1c Standardisation
HbA1c-Referenzlabor 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 HbA1c [%] 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 mean P1-P5 overall mean overall mean +/- 2.5 % Medizinische Analytik SS 2009

102 Bewertungs- grenzen [µg/L]
INSTAND e. V. Ringversuch 2005 HbA1c INSTAND e. V. HbA1c sample B [%] sample A [%] Referenzmethode Routinemethoden Probe Zielwert [µg/L] VK [%] Bewertungs- grenzen [µg/L] Mittelwert [µg/L] Bestehensquote [%] A 5.52 2.07 5.59 8.2 97.2 B 10.5 2.19 6.5 98.8

103 HbA1c Messergebnisse nach IFCC Referenzmethode und NGSP-Goldstein
INSTAND e. V. HbA1c Messergebnisse nach IFCC Referenzmethode und NGSP-Goldstein IFCC (%HbA1c) NGSP (%HbA1c) 12 10 8 6 4 2 NGSP = (0.915 * IFCC) Medizinische Analytik SS 2009

104 Darstellung von HbA1c - Werten
INSTAND e. V. Darstellung von HbA1c - Werten HbA1c Einheit NGSP abgeleitet: % IFCC abgeleitet: ab mmol/mol bis % Medizinische Analytik SS 2009

105 NGSP Werte [%] in IFCC Werte [mmol/mol]
INSTAND e. V. “Master Equation” Umrechnung NGSP Werte [%] in IFCC Werte [mmol/mol] IFCC [mmol/mol] = (NGSP [%] ) / Medizinische Analytik SS 2009

106 Darstellung von HbA1c - Werten
INSTAND e. V. Darstellung von HbA1c - Werten HbA1c NGSP [%] HbA1c IFCC [mmol/mol] new Referenz-Bereich: 4.0 – 6.0 % 20 – 42 mmol/mol Medizinische Analytik SS 2009

107 für Ihre Aufmerksamkeit
INSTAND e. V. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

108 ß-Kette von verschiedenen Hämoglobinen (N-Term. AA 1-9)
Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Ser HbA Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbS Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-Ser HbC Gly-His-Phe-Thr-Glu-Glu-Asp-Lys-Ala HbF AA

109 INSTAND e. V.

110 INSTAND e. V.