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Die Expressionsmuster pulmonaler Metastasen klarzelliger Nierenzellkarzinome spiegeln das krankheitsfreie Intervall sowie die Anzahl der Lungenmetastasen.

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Präsentation zum Thema: "Die Expressionsmuster pulmonaler Metastasen klarzelliger Nierenzellkarzinome spiegeln das krankheitsfreie Intervall sowie die Anzahl der Lungenmetastasen."—  Präsentation transkript:

1 Die Expressionsmuster pulmonaler Metastasen klarzelliger Nierenzellkarzinome spiegeln das krankheitsfreie Intervall sowie die Anzahl der Lungenmetastasen eines Patienten wider D. Wuttig 1, B. Baier 2, S. Fuessel 1, M. Meinhardt 3, S. Zastrow 1, C. Höfling 1, M.-O. Grimm 1, A. Meye 1, A. Rolle 2, M.P. Wirth 1 Transkriptomweite Expressionsanalysen an pulmonalen Nierenzellkarzinom-Metastasen gefördert von der Dr. Robert-Pfleger-Stiftung 1 Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden 2 Fachkrankenhaus Coswig, Zentrum für Pneumologie, Beatmungsmedizin, Thorax- und Gefäßchirurgie 3 Institut für Pathologie, Technische Universität Dresden

2 2 Nierenzellkarzinom und Metastasierung Nierenzellkarzinom (NZK) dritthäufigster urologischer Tumor Dtl.: Neuerkrankungen/Jahr [RKI, Stand 11/2004] urolog. Tumor mit höchster prozentualer Todesrate Metastasen ( 60% der Patienten; 50-60% in Lunge) medianes Überleben: 6–12 Monate Einleitung metastatic colonization dormancy Metastasierung metastasierungs-assoziierte Faktoren: Angiogenese, Zelladhäsion, Invasion, Migration [http://www.nccr-oncology.ch]

3 3 Zielstellung molekulare Faktoren, die mit Ausbildung variierender DFI und verschiedener Mets-Zahlen assoziiert (Microarray-Analysen) Untersuchungsmaterial 20 kryokonservierte Lungen-Mets von 18 Patienten mit klarzelligem NZK homogenes Patientenkollektiv: Nephrektomie, keine anderen Tumoren, nur operative Therapien (außer 1 Pat.), klin. keine distanten Mets vor Lungen-Mets-Diagnose Patienten mit frühen (synchronen) Mets sowie Patienten mit multiplen Mets haben extrem schlechte Prognose molekulare Ebene: aggressivere Tumorherde (höhere Proliferationsrate, aktivierte Angiogenese, bessere Fähigkeit zu Anlagerung und Anwachsen in Sekundärorganen) Hypothese Zielstellung Untersuchung pulmonaler Mets (1318nm Nd-YAG-Laser, FKH Coswig)

4 4 Oligonukleotid-Microarrays: Methodik und Auswertung Material & Methoden HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix), Transkripte ( Gene) Probenaufarbeitung Gewebeschnitte RNA cDNA biotinylierte cRNA Fragmentierung Hybridisierung und Waschen Scannen - Detektion via Phycoerythrin-markiertes Streptavidin (750 nm) - Fluoreszenzsignal Transkriptmenge 25nt-Sonden auf Glasmatrix Auswertung (Software: RMAExpress) - globale Background-Korrektur, Quantil-Normalisierung - Signalberechnung, Logarithmieren (Pseudonormalisierung) - differenziell exprimierte Transkripte: Fold Change = MW Gruppe 1 / MW Gruppe 2 |1,8| (t-Test, FDR<0,05)

5 5 Gruppeneinteilung: frühe vs. späte Metastasen DFI 9 Monate (0-9 Mon., Med=1 Mon.; n=5) vs. DFI 5 Jahre ( Mon., Med=92,5 Mon; n=6) 306 differenziell expr. Transkripte (späte Mets: 279, 27 ; 414 Sondensets) Expressionsunterschiede bei unterschiedlichem DFI I Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen DFI 5 years DFI 9 months Visualisierung: Principal component analysis, heat map (Auszug) DFI 9 months DFI 5 years

6 6 Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse) Motilität / Migration der Zellen Zelladhäsion Angiogenese aktiviert in späte Mets (z.B. KDR, PDGFB, PDGFA, PDGFRB, ETS1, CD31) Literaturrecherche lt. Literatur 73/306 (47%) metastasierungsassoziiert 75% in späten Mets reguliert wie für Tumoren beschrieben unerwartet, da Patienten mit frühen Mets schlechtere Prognose haben Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen späte Mets weisen höheres metastatisches Potential auf als frühe Mets

7 7 306 Gene (414 Sondensets) Vorhersagemodell (k-nearest neighbouring) Tumorbiologische Ursache? molekularen Unterschied zwischen synchronen und metachronen Mets Theorie Primärtumor bei Mets-Wachstum noch anwesend und somit selbst in der Lage zur Metastasierung metastatisches Potential der Mets gering Primärtumor bereits entfernt bei Beginn des Mets-Wachstums Mets entwickeln von Beginn an höheres Metastasierungspotential Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen frühe Mets (DFI 9 Monate) späte Mets (DFI 5 Jahre) 1/8 Mets (DFI=15 Monate) 7/8 Mets (DFI= Monate) 8 Mets (DFI = 11 – 30 Monate)

8 8 viele Mets wenige Mets Expressionsunterschiede bei unterschiedlicher Mets-Anzahl I 135 differenziell exprimierte Transkripte (viele MS: 50, 85 ; 163 Sondensets) Visualisierung: Principal component analysis, heat map Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen Gruppeneinteilung: wenige vs. viele Metastasen 8 (1-8, Med=3, n=10) vs. 16 (16-80, Med=24, n=7) Lungen-Mets/Pat. (klinisch: längeres Überleben für 9 vs. >9 Mets) [Rolle et al., J Thorac Cardiovasc Surg, 2006] viele Mets wenige Mets

9 9 Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen Grund für Unterschiede in MS-Anzahl sind möglicherweise verschiedene Wachstumseigenschaften der Tumorzellen Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse) Zellteilung und Zellzyklus (z.B. PBK, Survivin, PTTG1) aktiviert in viele Mets

10 10 Erstellung von Vorhersagemodellen Ausgangspunkt: Sondensets, deren differenzielle Expression mit zwei weiteren mathematischen Algorithmen validiert (GCOS, dCHIP) k-nearest neighbouring, weighted voting Vorhersagemodell zum DFI ( Mets) 6-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation richtige Einordnung einer weiteren Proben Ergebnisse: Vorhersagemodelle Vorhersagemodell zur Metastasenanzahl ( Mets) 11-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation richtige Einordnung dreier weiterer Proben Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential

11 11 Fold Change=5,5 p=0,004* (n=6) (n=5) späte Metsfrühe Mets viele Metswenige Mets Fold Change=2,5 p=0,002* (n=10) (n=19) Validierung der Microarray-Ergebnisse Ergebnisse: Validierung Expression von 6 Genen mittels quantitativer PCR validiert (TBP, CP) PTTG1 (pituitary tumor-transforming 1)GALNTL2 ( Median; * zweiseitiger t-Test basierend auf log 2 -Daten) (n=7) (n=10) Fold Change=2,7 p=0,001* Überexpression relativ zu fiktiver Probe mit CP=0 Fold Change=5,1 p=0,001* (n=11) (n=8) Array: Fold Change=2,1 p=0,002Array: Fold Change=3,4 p=0,002

12 12 Zusammenfassung und Ausblick molekulare Unterschiede verschiedener Mets-Charakteristika: verschiedene DFI spielgeln sich in unterschiedlichem metastatischen Potential der Mets wider verschiedene Mets-Zahlen aufgrund variierendem Wachstumspotentials Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential Ausblick Primärtumoren einbeziehen: Microarrays, Validierung (qPCR, Immunhistochemie) prognostisch relevante Gensignaturen Therapieregime anpassen Zusammenfassung

13 13 Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen GenTranskriptbezeichnungFold Change (spät/früh) p-Wert (t-Test) Funktion TNNT1troponin T type 10,190,008Schilddrüsen-Ca (Chromosomenaberration) PPM1Hprotein phosphatase 1H0,320,008 S100A2S100 calcium binding protein A20,350,008 NSCLC ( ); ass. mit Metastasierung XKX-linked Kx blood group (McLeod syndrome)0,350,008 MTAPmethylthioadenosine phosphorylase0,490,008NZK (LOH), Magen-Ca (Deletion, Hypermethylierung) SFTPCsurfactant, pulmonary-associated protein C17,560,002NSCLC (Deletion) PTGER3prostaglandin E receptor 37,330,004 Kolon-Ca ( ); G-coupled receptor-Familie TSPAN7tetraspanin 7, CD2316,530,002TSPAN2 (Zellmobilität, methyliert im Brust-Ca); TSPAN27 (Metastasierung) ADH1Balcohol dehydrogenase IB11,950,008Polymorphismen (Alkoholumsetzung) MYOCDmyocardin4,540,002 * based on t-Test (mean) Top 10 *: Expressionsunterschiede bei unterschiedlichem DFI II

14 14 GenTranskriptbezeichnungFold Change (viele/wenige) p-Wert (t-Test) Funktion GPR64G protein-coupled receptor 6411,370,004 RASGEF1ARasGEF domain family, member 1A4,630,006Zellkultur (Gallengangkarz.) Zellwachstum/-motilität PBKPDZ binding kinase3,060,002 Burkitt´s lymphoma ( ) E2F8E2F transcription factor 82,680,008E2F Familie (Regulation der Zellproliferation) ARNTL2aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 2 2,100,006 Leber-Ca ( ) SCGB1A1secretoglobin, family 1A, member 1 (uteroglobin; CC10) 0,070,002Zellkultur (NSCLC): TSG?; reguliert durch TITF1 TITF1Thyroid transcription factor 10,240,006Lungen-Adenokarzinome (gain) TMEM178transmembrane protein 1780,320,002 SCGB3A2secretoglobin, family 3A, member 20,110,006 SFTPGsurfactant associated protein G0,140,004 * based on t-Test (mean) Top 10 *: Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen Expressionsunterschiede bei unterschiedlicher Mets-Anzahl II

15 15 Metaanalyse MS vs. Primärtumoren (nicht-metastasiert, klarzellig) Publizierte Rohdaten zu Primärtumoren Lenburg et al. (2003) GEO accession number: GSE781 9 NZK Copland (2006) GEO accession number: GSE NZK Ergebnisse 3000 potenziell MS-assoziierte Sondensets 31 Gene aus MS-spezifischer 128-Gensignatur [Jones et al., Clin Cancer Res 2005, 11: Ramaswamy et al., Nat Genet 2003, 33: 49.] 23 Gene aus Lungen-MS-spezifischer 94-Gensignatur [Minn et al., Nature 2005, 436: 518.] untersuchte Lungen-MS ähneln hinsichtlich ihrer Genexpression MS, die in anderen Studien untersucht wurden Ergebnisse: Metastasen-assoziierte Gensignaturen

16 16 RMAGCOS (*.CHP-Daten)dCHIP ModellPM onlyPM-MMPM only Backgroundgloballokal NormalisierungQuantileLinear (Scaling auf mittlere Intensität 500) invariant set normalization Identifikation differentiell exprimierter Transkripte: 1. FC cut-off RMA; log 2 (FC) |0,85| (FC 1,8) 1011 Gene (269 in viele MS, 715 in wenige MS) log-Transformation log 2 (FC) |1,5| (FC 2,8) 1218 Gene (718 in viele MS, 500 in wenige MS) log-Transformation log 2 (FC) |1,0| (FC 2,0); p<0,05 (t- Test) 212 Gene (36 in viele MS, 176 in wenige MS) 2. t-Test FDR (BH) p < 0, Gene (57 in viele MS, 106 in wenige MS) 391 Gene (228 in viele MS, 163 in wenige MS) Methoden (Software) schlechte Chips aus Auswertung raus gelassen: 10, 21, 22, 24 restliche Chips (Anzahl:20) zusammen normalisiert (RMA, dCHIP)

17 17 Algorithmus RMAExpress (robust multi-array analysis) Normalisierung: (Quantil-Normalisierung) Angleichen der Verteilung der Sondenintensitäten in allen Arrays Signalberechnung: i…Probe (Array) j…probe set (1…J) PM BG,N,log…Background-korrigiert, normalisiert, log-transformiert n…probe set - entspricht Transkript(variante) S…Signal j …probe affinity effect ij …unabhängiger Fehlerterm (Mittelwert über alle probe sets =0) (Vergl. GCOS: PM-MM für jedes probe pair gewichteter Median)

18 18 t-Test-Korrektur für multiples Testen: False discovery rate (FDR) I t-Test: Irrtumswahrscheinlichkeiten und …falsch positive Ergebnisse (Typ I Fehler) … falsch negative Ergebnisse (Typ II Fehler) = 0,05 (5 %) Wahrscheinlichkeit von 5 %, dass ich ein falsch pos. Ergebnis erhalte 1 Test (z.B. 1 Gen in zwei Proben) mit einer Wkt. von 95 % ist das Gen wirklich diff. exprimiert, wenn es als signifikant verschieden (p<0,05) berechnet wurde 10 Tests (z.B. 10 Gene in zwei Proben) 1 – 0,95 10 = 0,401 (40 %) Wkt., dass Test nicht falsch positiv klassifiziert wird mit einer Wkt. von 40 % ergibt mind. einer der 10 Tests eine falsch positive Antwort oder: 5 % von 1000 Genen (50 Gene) werden falsch positiv klassifiziert ( = 0,05)

19 19 t-Test-Korrektur für multiples Testen: False discovery rate (FDR) II verschiedene Ansätze, die Rate der falsch pos. Ergebnisse zu verringern: FWER (family wise error rate) Gesamtfehlerrate (bezogen auf alle Tests) 0,05 = multipel (erzeugt falsch negative geringe Power) FDR (false discovery rate) (Benjamini & Hochberg) Gesamtfehlerrate (bezogen auf Tests mit pos. Ergebnis, also alle als diff. expr. klassifizierten Gene) 0,05 = multipel FDR = E (falsch pos/gesamt pos | R>0). P(R>0) 5% FDR: 2,5 Fehler bei 50 als diff. expr. klassifizierten Genen Ergebnis: entweder Signifikanzniveau oder p-Werte GenePattern adjustiert p-Werte

20 20 Auswertung: Probenmaterial ld. Nr.Nephrektomie MSAnzahl MSuni-/bilateralAlter (Primärtumor)Lymphknotenstatus 11 Monat44 ( )bilat.65negativ 21 Jahr + 3 Mon.10unilat.62? 37-8 Jahre18 (17 + 1)bilat.58? 41 Jahr4 (2 + 2)bilat.74negativ 5, 61-2 Jahre3 (2 + 1)bilat.69negativ 710 Monate16 (10 + 6)bilat.49positiv 82 Monate24 ( )bilat.66negativ 99 Monate1unilat.63negativ 118 Monate3unilat.59negativ 121 Monat24 (9 + 15)bilat.50negativ 131 Monat37 ( )bilat.58negativ 145 Jahre1unilat.59negativ 1513 bzw. 5 Jahre6 (4 + 2)bilat.49negativ 16, 177 Jahre8 (3 + 5)bilat.58negativ 1811 Monate 80 ( )bilat.64negativ Jahre2unilat.42positiv 2311 Monate2unilat.73negativ 2511 Jahre5 (3 + 2)bilat.57negativ Median 1 Jahr Gruppeneinteilung: Anzahl MS 8 vs. 16; Nephr. MS 2 J. vs. 5 J.; uni- vs. bilat.

21 21 platelet/endothelial cell adhesion molecule (CD31 antigen) tropomyosin 2 (beta) heparan sulfate proteoglycan 2 tetraspanin 7 surfactant, pulmonary-associated protein C intercellular adhesion molecule 2 Vorhersagemodelle secretoglobin, family 1A, member 1 (uteroglobin) G protein-coupled receptor 64 Thyroid transcripytion factor 1 transmembrane protein 178 RasGEF domain family, member 1A E2F transcription factor 8 PDZ binding kinase surfactant associated protein G secretoglobin, family 3A, member 2 breast cancer membrane protein 11 Ets homologous factor Metastasenanzahl: 11 Gene Metastasen-freies Intervall: 6 Gene

22 22 Arrayqualität Background sollte bei allen Proben gleich sein Scaling factor sollte max. um Faktor 3 variieren 3´/5´-Signal GAPDH % Present call Intensitätsverteilung über gesamten Chip (keine Hybridisierungsartefakte) keine Artefakte (Probe 1) Intensitätsartefakt (Probe 22) stark amplifiziertes Signal (Probe 10)

23 23 ursprüngliche Gruppeneinteilung: MSFI 2 Jahre (12 Proben) vs. MSFI 5 Jahre (6 Proben) (klinisch: kürzeres Überleben von Patienten mit MSFI < 2 Jahre als mit MSFI > 2 Jahre [van der Poel et al., Eur Urol 1999, 35: 197.] 645 differentiell exprimierte Transkripte (lang: 514, 131 ) Subgruppenvergleich: frühe vs. späte Metastasierung MSFI 5 Jahre MSFI 2 Jahre Visualisierung: Principal component analysis Expressionsunterschiede bei unterschiedlichem MSFI I


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