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Tab.1 Quantifizierung apoptotischer und polyploider/multinukleärer EJ28-Zellen.

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Präsentation zum Thema: "Tab.1 Quantifizierung apoptotischer und polyploider/multinukleärer EJ28-Zellen."—  Präsentation transkript:

1 Tab.1 Quantifizierung apoptotischer und polyploider/multinukleärer EJ28-Zellen. Durchflusszytometrische Analysen PI-gefärbter DNA dienten als Alternative zur Beurteilung apoptotischer und polyploider/multinukleärer EJ28-Zellen 72h nach Behnadlung mit si SVV284 und AS SVV286 oder den entsprechenden Kontrollen mit bzw. ohne 2.5ng/ml GEM. Die Anteile an Apoptose in der Sub G0/G1-Zellpopulation (Marker M1) und an Polyploidie (Marker M2) wurden anhand der Profile der PI-gefärbten DNA, wie in Abb.4 gezeigt, quantifiziert. Ansatzapoptotische Zellen (M1) n-fache Erhöhung der Apoptoserate multinukleäre Zellen (M2) n-fache Erhöhung der multinukleären Zellen si SVV si luciferase AS SVV NS K si SVV284+GEM si luciferase+GEM AS SVV286+GEM NS K1+GEM EJ GEM untreated Chemosensitivierung von Harnblasenkarzinomzellen durch gegen Survivin gerichtete AS-ODN und siRNAs S. Füssel, J. Herrmann, S. Ning, M. Kotzsch #, K. Krämer, U. Schmidt, O. Hakenberg, A. Meye, M.P. Wirth Klinik für Urologie und # Institut für Pathologie, Technische Universität Dresden Klinik für Urologie und # Institut für Pathologie, Technische Universität Dresden Zielstellung Survivin, ein Mitglied der IAP-Familie (inhibitor or apoptosis protein), stellt aufgrund seiner spezifischen Überexpression in zahlreichen Tumorarten ein gut geeignetes Target für Tumortherapien dar. Beim humanen Harnblasenkarzinom (BCa) korreliert die Survivin-Überexpression mit einem erhöhten Tumorgrad und Rezidivrisiko sowie mit einem schlechteren Überleben. In Vorarbeiten wurden das siRNA- Konstrukt (small interfering RNA) si-SVV284 und das Antisense-Oligodesoxynukleotid (AS ODN) AS SVV286 zur gezielten Ausschaltung von Survivin, das in zahlreichen BCa-Zelllinien überexprimiert wird, erfolgreich eingesetzt. Das Versagen lokaler und systemischer Chemotherapien (CT), z.B. mit Mitomycin C, Gemcitabin und Cisplatin, stellt ein großes Problem bei der Behandlung von BCa dar und wird häufig durch die verstärkte Expression antiapoptotischer Gene verursacht. Daher war es das Ziel dieser Untersuchungen, verschiedene BCa-Zelllinien durch eine Vorbehandlung mit den Survivin-Inhibitoren si-SVV284 und AS SVV286 für eine sich anschließende CT zu sensitivieren und deren zytotoxische Wirkung zu verstärken. Abb.1 Einfluss der Survivin-Hemmung in Kombination mit CT auf die Viabiliatät der BCa-Zelllinien EJ28 und Die Viabilitätsmessungen wurden mit Hilfe des WST-1-Tests 96h nach Start der Transfektion mit siRNA - bzw. ODN - Konstrukten und anschließender CT durchgeführt (Mittelwerte eine Fünffachbestimmung pro Ansatz + mittlere Abweichung). Die gemittelten Daten der isolierten Behandlungen mit si SVV284 bzw. AS SVV286 (normalisiert auf si Luciferase bzw. NS K1) stammen aus drei unabhängigen Experimentserien. Der Einfluss der isolierten CT mit CDDP, GEM bzw. MMC wurde auf unbehandelte Zellen (= 100%) der jeweiligen Serien bezogen. Die Behandlungen mit si SVV284 bzw. AS SVV286 mit bzw. ohne anschließende CT wurden auf die entsprechenden Kontrollbehand- lungen normiert (si Luciferase bzw. NS K1, = 100%). Über den entsprechenden Balken sind die Überlebenssraten (in %) und statistisch signifikante Differenzen nach Therapie mit si SVV284+CT in Relation zu si Luciferase+CT bzw. mit AS SVV286+CT in Relation zu NS K1+CT dargestellt (ungepaarter T Test: (* p 0.05, ** p 0.01, *** p 0.001). CDDP GEM MMC 1 / 2 µg/ml 1 / 2 µg/ml 1 / 2.5ng/ml 1 / 2.5ng/ml0.33 / 1 µg/ml 0.33 / 1 µg/ml *** 56% ** 42% ** 52% *** 38% *** 55% * 50% ** 46% *** 12% * 55% * 58% 103%33% * 38% ** 29% * 69% 73% *** 39% 58% *** 38% * 53% ** 33% 77% 85% * 61% Abb.5 Hemmung des Wachstums von EJ28-Zellen nach Survivin-Inhibierung. Die Zellen wurden 72h nach der Behandlung mit den siRNA- und ODN-Konstrukten mit bzw. ohne 2.5ng/ml GEM geerntet und gezählt. Die Zellzahlen als Proliferationsmaß (A) wurde verglichen mit der Hemmung der Survivinexpression auf mRNA- (B) und Proteinebene (C). G2/M polyploidic cells S sub- G0/G1 PI fluorescence Abb.4 Evaluierung apoptotischer und polyploider EJ28-Zellen nach PI-Färbung der DNA und durchflusszytometrischen Analysen. Die Quantifizierung der apoptotischen Zellen als Sub G0/G1-Population (Marker M1) und der polyploiden Zellen (Marker M2) wurde mit Hilfe der Software WinMDI2.8 vorgenommen. Zellzyklusarreste in G0/G1 und G2/M und die Synthesephase (S) sind gekennzeichnet. Material & Methoden Die Konstrukte si-SVV284 und AS SVV286 binden an das selbe mRNA-Motiv und bewirken darüber eine spezifische Hemmung der Survivin-Expression. Als Kontrollen dienten die gegen das nichthumane Gen Luciferase gerichtete siRNA- Konstrukt si Luciferase sowie das Nonsense-ODN NS K1. Die humanen BCa-Zelllinien EJ28 und 5637 wurden für 4h mit einem Gemisch aus dem Transfektionsreagenz Lipofectin und 250nM des entsprechenden Survivin-Inhibitors (Verhältnis 1:3) transfiziert. Für die Chemotherapeutika (CT) Mitomycin C (MMC), Gemcitabin (GEM) und Cisplatin (CDDP) wurden jeweils 2 Konzentrationen ermittelt, die eine geringe bis moderate Hemmung der Zellviabilität bewirken. Die Chemo-sensitivierungsexperimente mit einer ODN- bzw. siRNA-Vorbehandlung liefen nach folgendem Schema ab. Die Zellzahlen und die Viabilität (WST-1-Test, Roche) dienten als Maß der Proliferation. Die Apoptoseraten wurden nach Doppelfärbung mit Propidiumiodid (PI) und FITC-markiertem Annexin V (Annexin V-FITC Apoptosis Dectection Kit I; BD Biosciences) durchflusszytometrisch bestimmt. Die durchflusszytometrischen Zellzyklus-Analysen wurden mit Hilfe des CycleTest Plus DNA Reagent Kits (BD Biosciences) durchgeführt. Die Survin-mRNA-Expression wurde mittels quantitativer real-time PCR (QPCR) und die Survivin- Proteinexpression mit Hilfe eines spezifischen ELISA-Kits (DuoSet IC-ELISA; R&D Systems) untersucht. Aussaat Transfektion (4h) CT 72h20h 24h CDDP, GEM Inkubation für weitere 24, 48 oder 72h: WST-1-Test Zellzählung Apoptose-Messung Zellzyklus-Analysen 24h Abb.2 Effekte von si SVV286 und CDDP auf das Zellwachstum und die Polyploidie von EJ28-Zellen. Die Zellen wurden 96h nach Start der Transfektion mit 250nM si SVV286 mit bzw. ohne anschließende Behandlung mit 2µg/ml CDDP mikroskopisch beurteilt. Als Kontrollen dienten die Behandlungen mit si Luciferase mit bzw. ohne CDDP (125-fache Vergrößerung). Abb.3 Apoptose-Induktion in EJ28-Zellen nach Survivin- Hemmung und MMC-Behandlung durchflusszytometrisch bestimmt nach Annexin V FITC / PI-Doppelfärbung. Die Behandlung mit si SVV284 bzw. AS SVV286 mit bzw. ohne MMC (0.67µg/ml) wurde mit den entsprechenden Kontrollbehandlungen (si Luciferase bzw. NS K1) verglichen. Die n fache Erhöhung der Apoptose-Raten im Vergleich zu den entsprechenden Kontrollen sind über den jeweiligen Messbalken dargestellt. Ergebnisse & Schlussfolgerungen Die Vorbehandlung mit den beiden Survivin-Inhibitoren si SVV284 und AS SVV286 gefolgt von einer CT mit Cisplatin, Gemcitabin oder Mitomycin C verursachte eine starke Hemmung der Viabilität der BCa-Zelllinien EJ28 und Im Vergleich zu den entsprechenden Einzelbehandlungen wurde nach der Kombinationstherapie eine signifikante Verstärkung der Hemmraten beobachtet (Abb.1). Die mikroskopische Beurteilung behandelter EJ28-Zellen zeigte 96h nach Transfektionsstart eine deutliche Verminderung der zellulären Integrität und der Zellzahlen (Abb.2) ähnlich zu den Viabilitätsmessungen. Multinukleäre Zellen wurden nur nach Behandlung mit dem siRNA-Konstrukt si SVV284 beobachtet. Die Apoptose-Raten, die nach AnnexinV-FITC/PI-Doppelfärbung gemessen wurden, waren nach Kombinations- behandlungen stark erhöht wie in Abb.3 für MMC (0.67µg/ml) exemplarisch gezeigt wird. Eine deutliche Apoptose- Induktion mit Absolutraten von 20-30% apoptotischen Zellen wurde ebenfalls für die Kombinationstherapien mit si SVV284 oder AS SVV286 und 1.5µg/ml CDDP bzw. 2.5ng/ml GEM beobachtet (Daten nicht gezeigt). PI-gefärbte DNA wurde zur Abschätzung der Anteile an apoptotischen und multinukleären Zellen genutzt (Abb.4). Als Beispiel sind in Tab.1 Veränderungen dieser Zellpopulationen nach Behandlung mit siRNAs oder ODN GEM 72h nach Transfektionsstart dargestellt. Die Behandlungen mit si SVV284 bzw. AS SVV286 und GEM führten zu einer Apoptose- Erhöhung um den Faktor 6.4 bzw. 4.6 (Tab.1). Analog zu den mikroskopischen Beobachtungen wurden multinukleäre EJ28-Zellen nur nach Therapie mit si SVV284 mit und ohne CT beobachtet (14-16%, Tab.1). Außerdem wurde nach Kombinationstherapie im Vergleich zu den Einzelbehandlungen eine deutliche Reduktion der Zellzahlen beobachtet (Abb.5). Dies ging mit einer Hemmung der Survivin-Expression einher, wobei das siRNA-Konstrukt effektiver als das AS ODN wirkte (Abb.5). Nichtsdestotrotz bewirkten beide Inhibitoren in Kombination mit allen getesteten CT eine starke Hemmung der Proliferation von BCa-Zellen und könnten daher als mögliche additive Therapeutika zur spezifischen Chemosensitisierung beim BCa dienen.


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