Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Die Präsentation wird geladen. Bitte warten

Massenspektrometrie – eine Einführung H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie.

Ähnliche Präsentationen


Präsentation zum Thema: "Massenspektrometrie – eine Einführung H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie."—  Präsentation transkript:

1 Massenspektrometrie – eine Einführung H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie

2 Wozu dient die Massenspektrometrie? Mir ihrer Hilfe kann man die Masse von Atomen und Molekülen bestimmen. In einem Bereich von 1Da..>100kDa Mit einer Massengenauigkeit von bis zu 1ppm Mir ihrer Hilfe kann man die Menge von Verbindungen bestimmen. Durch die Massenselektivität gelingt das auch in Gegenwart von Beimengungen (mit anderer Masse). Von Probenmengen im Bereich < g Von Mengen im Bereich < g Über Fragmentierungen erhält man Strukturhinweise

3 Was sind die Voraussetzungen für eine MS-Messung? Die Moleküle müssen vereinzelt, d.h. von ihresgleichen und von allen anderen abgetrennt werden. Wechselwirkungen würden die Massenbestimmung stören. Die Moleküle müssen ionisiert werden. Die Ladung dient als „Griff“ um Kräfte auf das Molekül auszuüben. SubstanzeinlassIonenquelleAnalysatorDetektor

4 SubstanzeinlassIonenquelleAnalysatorDetektor Verdampfen der Probe ins Hochvakuum – Direkteinlass, Tiegeleinlass, direct inlet, „Schubstange“ Kopplung eines Gaschromatographen mit einem Massenspektrometer – GC-MS MS GC

5 Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum + Ins Vakuum einschleusen ++ VerdampfenIonisieren Radikalkationen EI

6 SubstanzeinlassIonenquelleAnalysatorDetektor positive Spannung für positive Ionen 0V Elektronenionisation* - EI * Die veraltete Bezeichnung ist Elektronenstossionisation Turbomolekularpumpe mBar

7 SubstanzeinlassIonenquelleAnalysatorDetektor Elektronenionisation* - EI Bei der (EI) wird die Substanz im Hochvakuum mit 70eV Elektronen beschossen. Der größte Teil der Energie wird nicht auf das Molekül übertragen. Lediglich 6-10eV dienen zur Ionisation nach dem Schema: M + e -  M e - Darüber hinaus werden noch 2-10eV Energie (sog. Überschußenergie) auf das Molekül übertragen. Das führt zur Anregung des Moleküls und zur Fragmentierung. Ein EI-Spektrum ist die Auftragung der Häufigkeit der im Zeitraum von s gebildeten Ionen gegen ihren m/z Wert (bei z=1 entspricht das der Masse).

8 SubstanzeinlassIonenquelleAnalysatorDetektor Wechselspannung Ioneneintritt Quadrupolanalysator (Quadrupolmassenfilter) Quadrupolstäbe m/z passend m/z zu klein m/z zu gross Detektor Ionenbahnen

9 SubstanzeinlassIonenquelleAnalysatorDetektor Sekundärelektronenvervielfacher SEV, secondary electron multiplier SEM Hoher Verstärkungsfaktor >10 6 geringes Eigenrauschen, schnell. Ionen Elektronen  V 100V

10 Die x-Achse ist eine m/z Skala! Die Peakhöhe wird auf den intensivsten Peak (100%) normiert. Das erste Ergebnis jeder Messung ist ein „Rohspektrum“ Die Peaks haben eine Breite, die von der instrumentellen Massenauflösung abhängt. Die angezeigten Massenwerte stellen die Schwerpunkte oder die Maximalwerte der Rohdatenpeaks dar. Oft werden die Rohdaten in ein Strichspektrum umgerechnet. Hier kann es zu Rundungs- problemen kommen

11 Kohlenstoff 12 C 98,9% 13 C 1,1% Chlor 35 Cl 75,7% 37 Cl 24,3% Brom 79 Br 50,7% 81 Br 49,3% 2 H 0.015% Wasserstoff 1 H % Das stöchiometrische Atomgewicht (average mass) ist das gewichtete Mittel der Isotopeneinzelgewichte 12,011 35,46 79,9 1,0079 Auch die Massen der reinen Isotope sind nicht ganzzahlig (Ausnahme 12 C) 12, , , , , , , ,91574 Isotopie und Atomgewichte alle Angaben in Dalton (Da)

12 Molekülionen sind meist eine Gruppe von Peaks, sie entsteht durch die Kombination der natürlichen Isotopen der beteiligten Elemente. Schrittweiser Aufbau des Isotopenclusters von C 6 H 4 BrCl C6C C6H4C6H C 6 H 4 Br C 6 H 4 BrCl

13 Molekulargewichtsdefinitionen (nach IUPAC) Das stöchiometrisches Molekulargewicht (average mass) ist die Summe der Atomgewichte. Darin sind die mit ihrer Häufigkeit gewichteten Isotope in ihrer natürlichen Verteilung enthalten. Das nominale Molekulargewicht ist die Summe der gerundeten Isotopenmassen (der häufigsten Isotope). Das „monoisotopische Ion“ ist die Kombination der häufigsten Isotope. Es ist nicht notwendigerweise der intensivste Peak eines Isotopenclusters. Eine Massenangabe wird als „exakte Masse“ bezeichnet, wenn sie mit einer Präzision von +-5ppm (oder +-5mDa) bestimmt oder berechnet wurde. Beispiel C 6 H 4 BrCl nominal 190 monoistopisch average exakte Massen C 6 1 H 4 37 Cl 79 Br C 6 1 H 4 35 Cl 81 Br nominal 192 bei nicht ausreichender Auflösung wird der Summenpeak mit m/z gefunden

14 Befinden sich auf der gleichen Nominalmasse zwei oder mehr Ionen verschiedener Elementarzusammensetzung, so muß die Auflösung des Massenspektrometers besonders erhöht werden, um diese unabhängig voneinander bestimmen zu können. Bei Werten von R 10%Tal > spricht man von Hochauflösung. Hochauflösung Unregistered Unregistered C 19 H 36 O C 20 H 40 m/z m/z Massenunterschied 0,037Da notwendige Auflösung 280/0,037= 7500

15 EI-Spektrum - Interpretationsansatz Skyline Molekülion Isotopenmuster Fragmentierungen charakteristische Ionen wohldefinierte Bruchstellen m/z 154/155/156/157 enthält 1 Chloratom M-15, M-15-28, M m/z 38/39; ; ; CH 3 CO C 2 H 4 HCl CH3CO + C3H7 + Alle EI-Beispielspektren sind der NIST Datensammlung entnommen

16 Was bestimmt den Zerfall von angeregten Radikalkationen? Bildung stabiler Kationen Abspaltung günstiger (=stabiler) Radikale Abspaltung stabiler (kleiner) Neutralteilchen

17 Beispiel 1 α-Spaltung m/z 30 m/z 58 m/z 86 m/z 101

18 Doppelbindungsregel Ist das Molekülion geradzahlig, so enthält das Molekül eine gerade Anzahl von N-Atomen (oder keine). Ist das Molekülion ungeradzahlig enthält es eine ungerade Zahl von N-Atomen Die Zahl der Doppelbindungen und/oder Ringe lässt sich folgendermassen berechnen: Wenn Stickstoff anwesend ist, muss das berücksichtigt werden: nC, nH, nN = Anzahl der Atome Stickstoffsregel

19 Beispiel 2 Keine Abspaltungen von CH 2 sondern von Ethen, Propen, Buten usw. m/z 29 m/z 57 m/z 71 m/z 142

20 Beispiel 3 McLafferty Umlagerung m/z 92 m/z 91 m/z 134

21 Beispiel 4 m/z 74 McLafferty Umlagerung: das ML-Ion beinhaltet die Alkoholseite und die Position 2 des Esters. Substitution an diesen Positionen verschiebt das Produktion.

22 Beispiel 5 Diese Verbindung enthält nur 1 Heteroatom.

23 Massenspektrometrie – eine Einführung Beispiel 6 EI-Spektrum Molekulargewicht Skyline Auffällige Isotopenmuster              m/z m/z 182 wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139 bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten.

24 Massenspektrometrie – eine Einführung EI-Spektrum Molekulargewicht Skyline Auffällige Isotopenmuster              m/z m/z 182 wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139 bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten. SummenformelC8H19ClO2 C9 H7 Cl O2 C10H11ClO C11H15Cl „übersättigt“ maximal wäre H17 6 Doppelbindungsäquivalente 5 Doppelbindungsäquivalente 4 Doppelbindungsäquivalente DBE = ((2*Zahl der C-Atome + 2)-Zahl der H-Atome)/2 Cl zählt als einbindiges Atom wie ein H. Beispiel 6

25 Massenspektrometrie – eine Einführung EI-Spektrum Molekulargewicht Skyline Auffällige Isotopenmuster              m/z m/z 182 wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139 bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten. SummenformelC9 H7 Cl O2 6 DBE - C10H11ClO - 5 DBE - C11H15Cl 4 DBE Schlüsselionm/z 77 mögliche Partialstruktur CO oder C2H4 C3H7 oder C2H3O Phenylring Beispiel 6

26 Massenspektrometrie – eine Einführung EI-Spektrum              m/z einige Strukturmöglichkeiten (Substitutionsmuster am Aromaten unberücksichtigt) bei diesen Strukturen erwartet man einen [M-CH3]+ Peak bei m/z 167 Beispiel 6

27 Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum + Ins Vakuum einschleusen ++ VerdampfenIonisieren Radikalkationen Laserbeschuss + Ins Vakuum einschleusen Matrixpräparation Kationen + + EI MALD I

28 LDI und MALDI + Man kann Verbindungen durch einen intensiven Laserpuls verdampfen und ionisieren. Diese Laser-Desorption-Ionisation mit einem N2Laser erfordert eine Bestrahlungsstärke von ca. 5MW/cm 2. Empfindliche, polare und grosse Moleküle werden bestenfalls als Fragmente detektiert. Um Fragmentierungen zu verhindern, wird die Probe mit einem grossen Überschuss einer Matrixsubstanz gemischt und auf der Probenfläche cokristallisiert. Dieses Gemisch liefert bereits bei 0.5 MW/cm 2 Bestrahlungsstärke intakte Ionen. Es wird als Matrix-Assistierte Laser-Desorption-Ionisation bezeichenet Die universellste Matrix ist 2,5-Dihydroxybenzoesäure, sie wurde von F. Hillenkamp und M. Karas eingeführt. Target mit 16x24 = 384 Probenpositionen

29 MALDI + Bei der MALDI werden im Gegensatz zur Elektronenstoßionisation keine Radikalkationen erzeugt, sondern es entstehen meist* Ionen mit gerader Elektronenzahl. Weil der gefundene m/z Wert nicht gleich dem Molekulargewicht ist, spricht man von Pseudomolekularionen. Die Überschußenergie ist wesentlich geringer, s.d. man überwiegend intakte Pseudomolekularionen beobachtet. Die Ionisation ist hervorragend für große Moleküle geeignet (Peptide, Proteine DNA, RNA Fragmente, Oligomere) positivnegativ *Bei Matrices mit Elektronenübertragung (z.B. DCTB) enstehen Radikalkationen oder/und Radikalanionen.

30 MALDI + Spektrum einer basischen Verbindung C 30 H 43 NO 2 MW Als Matrix wurde 2,5-Dihyroxybenzoesäure verwendet. Unter günstigen Umständen (wie diesen) sieht man nur den Pseudomolekularpeak der Probe.

31 Flugzeitmassenspektrometer – „time of flight“ TOF Idealer Analysator bei pulsweiser Ionenproduktion wie sie bei MALDI und LDI vorliegt Probe auf Hochspannung (U) ca. 20kV Laserimpuls Detektor t Intensität Gitter auf 0V Flugrohr (Länge l) t Intensität e U = ½ m v 2 sqrt(2eU/m) = v = s/t e = Elementarladung U = Beschleunigungsspannung m = Masse eines Moleküls s = Länge des Flugrohrs t = Flugzeit

32 MALDI + Spektrum eines Oligomeres – Ionenbildung durch Na+ Anlagerungen Abstand 44 Da Matrixionen Masse der repetierenden Einheit 44Da Masse der Endgruppen = 18Da * = 18 Vorschlag Polyethylenglycol

33 Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum + Ins Vakuum einschleusen ++ VerdampfenIonisieren Radikalkationen + + Probe gelöst, Ionenbildung!Versprühen im E-Feld Transfer zum Vakuum Kationen Laserbeschuss + Ins Vakuum einschleusen Matrixpräparation Kationen + + EI MALD I ESI

34

35 Welche Pseudomolekularionen können bei ESI beobachtet werden? Positivmodus Bei Gemischen auch Heterodimere[M+H] + [M+NH4] + [M+Na] + [M+K] + [2M+H] + [2M+NH4] + [M+2H]2 + [M+2Na]2 + [M+H+Na]2 + Bei sehr leicht oxidablen Verbindungen [M-e] +  Negativmodus Bildung von Dimeren etc wie im Positivmodus[M-H] - [M+Cl] - [M+HCOO] - usw.

36 ES(I) 1cm Kontaktierung (0.6-2kV) Kapillare mit 10ul Probenlösung Sehr feine Spitze Ioneneintritt zum MS Geöffnete Sprühkammer N2 Strom zur Desolvatation Nanosprayeinlass ESI aus einer Stahl- kapillare (Schleifeneinlass, HPLC)

37 HPLC-MS Kopplung HPLC- Pumpe Autosampler Injektionsventil Trennsäule ESI-MS

38 ES(I) – Electrosprayionisation Amino-3-methylbutanol Auch bei sehr empfindlichen Verbindungen keine Fragmentierung (M+H) + K+K+ zum Vergleich das EI-Spektrum kein Molekülpeak sichtbar dafür Strukturinformation durch die Fragmentierung!

39 Um welches Polymer könnte es sich handeln? Die beobachteten Ionen sind NH4 + -Anlagerungen. Abstand betrachten Isotopenpeaks beachtenC 2 H 6 O Si

40 Grosse Moleküle unter ESI-Bedingungen Beispiel Cytochrom C Δm/z = 1/15 =

41 Normal(scan)betrieb eines „Triplequads“ IonenquelleQuadrupol 1Quadrupol 2StosskammerDetektor IonenquelleQuadrupol 1Quadrupol 2StosskammerDetektor Tochterionenmodus Nur ein m/z Fragmentierung MS-MS Experiment –Daughter ions

42 Gegenüberstellung EI  ESI EI ESI

43 Musteranalyse 1 Flüssigkeit leicht löslich in MethanolESI Zugabe von NH 4 OAc Gerade Zahl von N Nicht basisch MW 162

44 Musteranalyse 1 Tochterionenspektrum von m/z NH Anwesenheit von Heteroatmen Mögliche Summenformeln für m/z 163 bei einer Genauigkeit von Da Nur C,H,O zugelassen.

45 Musteranalyse 1 Messung der exakten Massen Damit ist die Summenformel der neutralen Verbindung als C 8 H 18 O 3 bestimmt Sie enthält keine Doppelbindungen oder Ringe Im Tochterionenspektrum war kein H 2 O Verlust sichtbar. Vermutlich handelt es sich um einen Ether.

46 Musteranalyse 1 Tochterionenspektrum mit exakter Massenbestimmung -C 2 H 6 O = Ethanol -C 2 H 4 O symmetrisch?

47 Musteranalyse 1 GC-MS-EI

48 Musteranalyse 1 EI Spektrum z.B. mit GC Einlass Spektrensuche in der NIST-Datenbank ( Spektren) Vergleichsdarstellung mit dem besten Treffer MW 162

49 Musteranalyse 2 Wasser/Methanol-lösliche Substanz enthält eine aromatische Carbonsäure (als Ester) enthält einen (?) Zuckerrest enthält Quercetin (en Flavonoid) trägt am Ring Substituenten C 6 H 12 O 6 oder C 5 H 10 O 5 Methode ESI oder HPLC-ESI-MS C 28 H 25 O 16 DBE 16.5 Abweichung mDa

50 Musteranalyse 2 C 6 H 12 O 6 oder C 5 H 10 O 5 trägt am Ring Substituenten MS-MS (Tochterionen) HCD Die Gallussäure und der Zucker müssen miteinander verbunden sein

51 Musteranalyse 2 MS-MS (Tochterionen) CID Das Quercetin und der Zucker müssen miteinander verbunden sein. 2 Alterantiven Es gibt kein Ion in dem Quercetin zusammen mit dem Galloylrest vorkommt

52 Schema eines oTof Massenspektrometers

53 What‘s new in the MS-group? LTQ-Orbitrap XL (ETD)

54 Complete Scheme Demo Orbitrap

55 LTQ Orbitrap™ Hybrid Mass Spectrometer API Ion source Linear Ion Trap C-Trap Orbitrap Finnigan LTQ™ Linear Ion Trap Differential pumping Inventor: Dr. Alexander Makarov, Thermo Electron (Bremen) Die Folien zur Orbitrap stammen aus einer Demonstration der Fa. Thermo Fisher Scientific

56 LTQ Orbitrap Operation Principle 1. Ions are stored in the Linear Trap 2. …. are axially ejected 3. …. and trapped in the C-trap 4. …. they are squeezed into a small cloud and injected into the Orbitrap 5. …. where they are electrostatically trapped, while rotating around the central electrode and performing axial oscillation The oscillating ions induce an image current into the two outer halves of the orbitrap, which can be detected using a differential amplifier Ions of only one mass generate a sine wave signal

57 The axial oscillation frequency follows the formula Where  = oscillation frequency k = instrumental constant m/z = …. well, we have seen this before Frequencies and Masses Many ions in the Orbitrap generate a complex signal whose frequencies are determined using a Fourier Transformation

58 The Orbitrap

59 Trajectories in the orbitrap Characteristic frequencies: –Frequency of rotation ω φ –Frequency of radial oscillations ω r –Frequency of axial oscillations ω z r z φ

60 Effect of resolution: example North Sea Oil „Gull Faks“ Nanospray positive Resolutions: unit res

61

62

63

64


Herunterladen ppt "Massenspektrometrie – eine Einführung H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie."

Ähnliche Präsentationen


Google-Anzeigen