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Mechanismus der V(D)J Rekombination
Signale auf DNA Ebene: RSS Rekombinasekomplex Spaltung und Verknüpfung der Segmente
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V(D)J Rekombination Deletion und Inversion
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Erkennungssequenzen auf DNA Ebene
RSS: „recognition signal sequences“ 1-turn Signal: Heptamer-12-Nonamer 2-turn Signal: Heptamer-23-Nonamer Rekombination nur zwischen 1-turn Signal und einem 2-turn Signal möglich
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Anordnung der RSS für einen Lokus identisch,
bei verschiedenen Loci unterschiedlich weiss: 1-turn schwarz: 2-turn
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Verknüpfung der Signalenden: präzise
Verknüpfung der kodierenden Segmente: „unpräzise“
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Einzelschritte der V(D)J Rekombination:
Zusammenführung der Signale Spaltung und Bildung der Haarnadelschleife Öffnen der Haarnadelschleife und Endbearbeitung Reparatur und Ligation
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Synapsis: kombiniertes Schneiden, Zusammenführen der Enden in Komplex, der alle 4 Enden bindet
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RAG1 und RAG2 (recombination activation genes)
V(D)J Rekombinase: RAG1 und RAG2 (recombination activation genes) einzige lymphoid-spezifische Faktoren für Rekombination andere Faktoren in allen Zellen vorhanden k.o. Mäuse: keine reifen T und B Zellen, keine anderen Defekte RAG1 + RAG2 binden RSS und spalten DNA zwischen Heptamer und kodierendem Segment 2 Stufen: Nick am 5´-Ende des Heptamers Hairpin Bildung Mg2+ HMG1 und 2 erhöhen Effizienz der Spaltung am 2-turn RSS und bevorzugte 1-turn + 2-turn Paarung
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Spätere Stadien der Rekombination:
Spalten des Hairpin und Verknüpfung der Enden DNA Doppelstrangbruch-Reparaturenzyme: DNA-PK Artemis Ku Proteine DNA Ligase IV XRCC4 Histon H2AX Mre11/Rad50/Nbs1 Komplex
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Öffnen des Hairpin: DNA-PK phosphoryliert und aktiviert Artemis, Endonuklease, welche Hairpin spaltet
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„Junctional Diversity“
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„Coding joints“ Nukleotide gehen verloren, kommen neu dazu (ohne Template) P-Nukleotide: „hairpin“ N-Nukleotide: TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) bis zu 15 N Exonuklease
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Artemis: bei Defekt humane SCID Form
DNA-PK bindet und aktiviert Artemis durch Phosphorylierung, Artemis bekommt dadurch Endonuklease-Aktivität für Hairpin und 5´- und 3´-überhängende Einzelstrang-DNA DNA-PK besteht aus Katalyt. DNA-PKs Untereinheit und Ku Protein-Heterodimer (Ku70 und Ku80) Ku bindet DNA, überbrückt Enden DNA Ligase IV / XRCC4 Komplex auch wichtig, da defekte Zellen bestrahlungssensitiv sind, und keine signal- oder coding joints machen können weiters vermutlich beteiligt: Histon H2AX Mre11/Rad50/Nbs1 Komplex: DNA repair in Hefe fördert Verknüpfung von DNA an Mikrohomologien ?
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Nonhomologous DNA end-joining proteins
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Regulation der Zugänglichkeit eines Lokus
Hypothesen: Germ line Transkription DNA Demethylierung Histon Acetylierung
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Rekombination und transkriptionelle Aktivität
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Non T cells Early thymocytes E deleted
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Stadien der B Zellreifung
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Stadien der T Zellreifung
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