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 Einführung  Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen  Grundlagen Kryokonservierung  Der Einfriervorgang  Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“

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Präsentation zum Thema: " Einführung  Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen  Grundlagen Kryokonservierung  Der Einfriervorgang  Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“"—  Präsentation transkript:

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2  Einführung  Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen  Grundlagen Kryokonservierung  Der Einfriervorgang  Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“  Kryobanken: Lagerung der Zellen  Kryokonservierung von hESC  Fallbeispiele  Probleme  Ausblick Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

3 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 3

4 Embryonale Stammzellen (ESC) [1][1]  Besitzen mindestens zwei Eigenschaften: 1. self renewal durch asymmetrische Zellteilung 2. Pluripotenz Fähigkeit, sich in alle Zellen der drei Keimblätter zu differenzieren (Ecto-, Endo- und Mesoderm)  Entdeckung murine ESC (1981), humane ESC (1998), Induzierte pluripotente Stammzellen (IPS) (2006/07)[2][2]  Gewinnung aus der inneren Zellmasse von Blastozysten  Regulierung der Forschung in Deutschland über das Embryonenschutzgesetz Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

5 Adulte Stammzellen  im Allgemeinen geringeres Selbsterneuerungsvermögen  eingeschränktes Differenzierungspotential (Multipotenz)  Während der gesamten Lebensdauer zu finden, v.a. in Organen wie Knochenmark, Haut, Leber, Nabelschnur(blut), etc. IPS – Induzierte pluripotente Stammzellen  Adulte Stammzellen, die durch Reprogrammierung in pluripotente Stammzellen umgewandelt wurden  bis dato ist die absolute Übereinstimmung mit ESC nicht eindeutig bestimmt Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

6 Abb. 1: Überblick IPS/ Differenzierung [15][15]

7  Gewinnung aus der inneren Zellmasse der Blastozyste › Zerstörung der Trophoblasten durch Laserstrahl/Antikörper  Kultivierung [3]:[3] › Feederzellen Monolayer (inaktivierte murine embryonale Fibroblasten) › Koloniewachstum -> 3D Struktur Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

8  Grundlagenforschung der molekularen Mechanismen (z.B. Differenzierung )  Klinische Forschung › Zell- und Gewebeersatz › Immunsystemaufbau (HIV)  Krankheits- und Patientenspezifische Behandlung  Zellmodell für toxikologische/ pharmakologische Untersuchungen Lagerung und Bereitstellung von hESC Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

9 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 9

10 Verfahren für das Lagern (Einfrieren) von Zellen in lN 2  Der Einfrierprozess  Langsames vs. schnelles Einfrieren  Zellschäden durch extra- und intrazelluläre Eisbildung  Kryoprotektiva als Frostschutz  (im)permeable Substanzen  Lagerung der Zellen in Kryobanken  Vorschriften, Handling und Qualitätskontrolle Seminar Masterstudiengang Biotechnologie [16]

11 Zwei Einfriergeschwindigkeiten: 1. Langsam (Kristallisation) Wässrige Lösung gefriert unter Phasentrennung, wobei es zur Aufkonzentration der gelösten Stoffe kommt (Gefrierkonzentration)  Eutektisches Verhalten 2. Schnell (Vitrifikation) a. Extrem schnelle Abkühlung, die zur sog. Glasbildung führt z.B. direkter Kontakt mit lN 2  Übersättigte Lösung b. unkontrolliertes Einfrieren Seminar Masterstudiengang Biotechnologie Abb. 3: kristalline Mannitstruktur (links), amorphe Saccharosestruktur (rechts) [3][3]

12 Verhalten von Zellsuspensionen bei kristallinem Eis dendritisches Wachstum der extrazellulären Wasserphase der Lösung  Schädigungen der Zellen v.a. durch extrazelluläre Effekte Seminar Masterstudiengang Biotechnologie Extrazelluläre Schäden Zelldeformationen aufgrund der Zelldichte in interdentritischen Kanälen Mechanisch bedingte Schäden aufgrund von Zellschrumpfen Osmotisch bedingte Schäden (solutions effects) Membranporenbildung [14]

13 Zelleffekte bei Vitrifikation Schnelles Abkühlen führt zu intrazellulärer Eisbildung ( flash out Effekt )  Schädigungen der Zellen durch intrazelluläre Eisbildung aufgrund von ice seeding durch Membranporen Zwei-Faktor-Hypothese (Mazur et al.) [6]:[6] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie Abb. 4: Schema der 2-Faktor Hypthese von Mazur

14 Stoffe, die positive Effekte auf die Überlebensrate während des Einfrieren ausüben  Verbreiterung des optimalen Kühlratenbereichs Seminar Masterstudiengang Biotechnologie Permeable StoffeImpermeable Stoffe Kolligative EffekteNicht-kolligative Effekte Reduktion der Elektrolytkonzen- tration während des Einfrierens Umstrukturierung der Wassermo- leküle Verringerung der solution effectsStabilisierung der Membranen und Proteine -> intrazelluläre Eisvermeidung Toxisch in hohen Konzentrationen und bei RT Im Allgemeinen geringere Wirkung DMSO, Glycerin, MethanolTrehalose, Hydroxyethylstärke

15 Internationaler Forschungsfortschritt bedingt die Registrierung, Lagerung und Verwaltung von biologischem Material (UK Stem Cell Bank, HUES, …)  Ziel: metabolisch inaktiver Zustand, der Langzeitstabilität garantiert  Verschiedene Möglichkeiten der Konservierung [7]:[7] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie MaterialLagerungLagerzeit versch. Bakterien, Hefen, PilzeGefriertrocknung5 – 35 Jahre PflanzensamenlN 2 > 10 Jahre StammzellenlN 2 15 Jahre

16 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 16

17  mechanische Dissoziation in Klumpen von Zellen › Enzymatisches Ablösen der Zellen (hESC zusammen mit Feederzellen)  10 – 20 Zellklumpen pro Kryosubstrat  Auswahl der geeigneten Abkühlrate  Resuspension der Zellen in geeignetem Kryomedium Seminar Masterstudiengang Biotechnologie [17] [18]

18 1. Kontrolliertes Einfrieren Probe wird mithilfe eines Einfrierautomaten kontrolliert eingefroren › Kühlrate variierbar › Schrittweises Abkühlen möglich › Reproduzierbare Protokolle 2. Unkontrolliertes Einfrieren Probe wird direkt in Gefrierschrank/ lN2 überführt  Vitrifikation Probe wird direkt in LN 2 gefroren Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

19 Controlled-rate freezing of hESC [8][8] Kryomedium:90% Kulturmedium + 10 % DMSO Kryosubstrat:0,25 ml Cassou Straw Kontrolle:I) ohne Kryokonservierung (Probe A) II) unkontrolliertes Einfrieren bei -80 °C (Probe B) 19 SchrittProbeProzedurZeit [min] 1alleÄquilibrierung der Zellen in Kryomedium15 2alleEinfrieren bei -10 °C1 3D – FIce seeding5 4C + DAbkühlen auf -33 °C1 °C / min 4EAbkühlen auf -33 °C1,8 °C/ min 4FAbkühlen auf -33 °C2,7 °C /min 5C - FÜberführung in lN 2 > 5 min 6C - F Auftauen bei Raumtemperatur (RT)

20 Vitalität  Kontrolliertes Einfrieren mit Ice seeding optimal  Höhere Einfrierraten wirken sich negativ auf die Vitalität aus Seminar Masterstudiengang Biotechnologie ProbeEinfrierrateVitailität Kontrolle (A) -100 % Kontrolle (B)direkt bei -80 °C1 % ± 0,6 C1 ° C / min3,0 % ± 2,0 D (seeding)1 °C / min79 % ± 15 E (seeding)1,8 °C / min65 % ± 20 F (seeding)2,7 °C / min20 % ± 10

21 Improved cryopreservation of hESC with trehalose [4][4] Kryomedium :90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO + 0,2 mol/ l Trehalose Kryosubstrat: 0,5 ml Kryovial Kühlrate: 1 °C / min auf – 80 °C, nach 12 h in lN 2 Kontrolle: 90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO 21 ProbeKryomediumAuftaumedium Kontrolle (A) -- Bmit Trehalose- C- D

22 Differenzierungsstatus:  n = 75 Kolonien  Jüngere Passagen erholen sich besser nach der Kryokonservierung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie Probe Undifferenzierte Kolonien [%] Passage 28 Undifferenzierte Kolonien [%] Passage 38 A1613 B4135 C4344 D5145

23 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

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25 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 25

26 [1]:Human embryonic stem cells, Pera M.F., Reubinoff B., Trounson A., J. Cell. Sci., 2007, 113: 5-10 [2]:Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Takahashi K. et al., Cell, 2007 Nov 30, 131 (5): [3]:Embryonic Stem Cell Lines Derives from Human Blastocysts, J.A. Thomson et al., Science, 1998, 282: 1145 [4]: Improved cryopreservation of human embryonic stem cells with trehalose, Chun F. Wu et al., Reproductive BioMedicine Online, 2005, 11, 6: [5]:The Banking and Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cells, Charles J. Hunt, Transfusion medicine Hemotherapy, 2007, 34: , [6]:A two-factor hypthesis of freezing injury: Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells, Mazur et al., Experimental Cell Research,1971, 71: [7]:Biobanking, John G. Day, Glyn N. Stacey, Mol. Biotechnol., 2008, 40: [8]:Controlled-rate freezing of human ES cells, Carol B. Ware, Angelique M. Nelson, Anthony Blau, BioTechniques, 2005, 38: [13]:Ein Mikro-Waageverfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der Sublimationsgeschwindigkeit während der Gefriertrocknung, Dissertation Claudia Roth, Universität Erlangen-Nürnberg, Claudia_Roth/html/ Dissertation-Roth.html [14]:Cryosurgery, Boris Rubinsky, Annual review of Biomedical Engineering, 2000, Vol. 2: [15]:http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipsc- pathway.Par.0001.Image.566.gifhttp://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipsc- pathway.Par.0001.Image.566.gif [16]:http://www.sciencedaily.com/images/2008/09/ large.jpghttp://www.sciencedaily.com/images/2008/09/ large.jpg [17]:Kryovial, [18]:Kryo straws, Seminar Masterstudiengang Biotechnologie


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