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Grundlagen der mikrobiologischen Arbeitstechniken VO 1.

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Präsentation zum Thema: "Grundlagen der mikrobiologischen Arbeitstechniken VO 1."—  Präsentation transkript:

1 Grundlagen der mikrobiologischen Arbeitstechniken VO 1

2 Studienplan VL jeweils Mi, 1130 Uhr bis inkl Pflichtmodul 10: –GL der mb Arbeitstechniken –Biotechnologie –Einführung in die Systematik der MO Vorraussetzung für: –StPlan 2008: Pflichtmodul 11 –StPlan 2003: Mikrob. GrundUE »parallel zur VL Besuch der GrundUE möglich »Zeugnis GrundUE nur mit Arbeitstechniken I Prüfung: –Termine, am Ende der VL:

3 Inhalt 1. Einführung 2. Sterilisation und Keimreduktion 3. Steriles Arbeiten 4. Kultivierung von MOs 5. Anreicherung und Isolierung 6. Aufbewahrung und Konservierung

4 Literatur Wallhäußer, K.H., 1995: Praxis der Sterilisation – Desinfektion – Konservierung, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York. Madigan, M.T., Martinko, J.M., Parker, J., 2003: Brock Mikrobiologie, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Berlin. Bast, E., 2001: Mikrobiologische Methoden, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg. Wistreich, G.A., 2003: Microbiology Laboratory – Fundamentals and Applications, Pearson Education, Upper Saddle River. Alexander, S.K., Strete, D., 2001: Mikrobiologisches Grundpraktikum, Pearson Education, München, Boston. Fuchs, G., Schlegel, H.G., Allgemeine Mikrobiologie, 8. Auflage, Thieme, Stuttgart, New York.

5 1. Einführung EinführungsVL, beschäftigt sich nur mit Grundlagen, die in anderen VLs vertieft werden –Labormethoden –Systematik –Biochemie –Angewandte Mibi –Physiologie –Arbeitstechniken II –usw., usw., usw.

6 1. Einführung Mikrobiologie ganz allgemein beschäftigt sich mit lebenden Zellen und damit, wie diese ihre Aufgabe(n) erfüllen Eigenschaften lebender Zellen –Fähigkeit zur Reproduktion –Differenzierung –Kommunikation –Evolution

7 1. Einführung Grundelemente einer Zelle –Proteine –Lipide –Nukleinsäuren –Polysaccharide Mikrobiologie beschäftigt sich mit: –Eukaryonten (Mikroalgen, Pilze, Protozoa) –Prokaryonten (Bacteria, Archaea) –Viren (als nicht selbstständig lebensfähige Teilchen ohne eigenen Stoffwechsel und eigene Reproduktionsfähigkeit)

8 1. Einführung Mos unterscheiden sich von Pflanzen und Tieren v.a. durch –geringere Größe und geringere morphologische Differenzierung –Stoffwechselphysiologische Vielfalt –Anpassungsfähigkeit –hohe Stoffumsatzraten –hohe Synthese- und Vermehrungsraten –nahezu Allgegenwart –weltweite Verbreitung

9 1. Einführung Größenvergleich (ca.): –Protozoa:1 bis 15 µm –Pilze:10 bis 15 µm –Algen:ca. 30 µm –Bakterien:0,2 bis 10 µm –Viren:noch eine Dimension kleiner

10 1. Einführung Robert Koch (*1843) Kochsche Postulate 1.Pathogener MO in allen kranken Tieren vorhanden, fehlt aber in allen gensunden 2.Kultivierung (Agarplatte) – Reinkultur 3.gesundes Tier mit Reinkultur infizieren 4.aus infiziertem Tier kann der pathogene Organismus wieder isoliert werden (Reinkultur)

11 Grundsätzliches: –Zahlen: dt: Komma (16,46) engl: Punkt (16.46) mehrstellige Zahlen nicht mehr mit Komma (falsch: z.B. 53, ) sondern mit Leerzeichen (richtig: z.B ) trennen für große Zahlen Zehnerpotenzen verwenden: wird zu: 5,34 * Einführung

12 Genauigkeit: –richtet sich nach der Genauigkeit der verwendeten Messmethode –Bei der Angabe von Ergebnissen sind soviel Stellen anzugeben, dass die vorletzte Stelle noch sicher, die letzte jedoch bereits als unsicher gilt. –16,46 43,236 59,696 ergibt 59,69 –bei Rechnungen am Computer IMMER mit der exakten, niemals mit der gerundeten Zahl rechnen –Zahlen überschlagen 1. Einführung

13 Genauigkeit: –Zahlen überschlagen: auf einer Platten sind Bakterienkolonien zu sehen als Rechenergebnis kommen Zellen pro Einheit heraus :-( 1. Einführung

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20 Mol: 1 Mol einer Substanz sind 6,022 x Moleküle dieser Substanz Avogadro: Teilchenzahl N pro Stoffmenge n –Molar (M; mol/l): Mol einer Substanz in 1000ml Lösung Masse pro Volumen –Molal (mol / 1000 g Lm): Mol einer Substanz pro 1000g eines Lösungsmittels Masse pro Masse –Molverhältnis (mol %): Mol einer Substanz pro 100 ml eines Lösungsmittels

21 1. Einführung Masseprozent: weight per weight –Gramm des gelösten Stoffes in 100 g Lösung –Angabe: (w/w) Grammprozent: weight per volume –Gramm des gelösten Stoffes in 100 ml –Angabe (w/v) –Beispiel: 10% (w/v) Glucose in A.d. Volumsprozent: volume per volume –ml des gelösten Stoffes in 100 ml Lsg. –Angabe (v/v) –Beispiel: 10% (v/v) Acetonitril in A.d. –oder: 10% (v/v) aqu. Acetonitril

22 1. Einführung Literatur zum Chemisch-Rechnen: Hillbrand U., 2007, Stöchiometrie. Springer, Berlin, Heidelberg. Wittenberg W., 2005, Rechnen in der Chemie, Grundoperationen, Stöchiometrie. 15. Auflage. Springer, Wein, New York. Pflichtmodul I

23 1. Einführung

24 Herstellung von 100 ml einer 50 mM KH 2 PO 4 Lsg.: –M KH2PO4 = 136,09 g/mol –0,68 g 100 ml -1 für eine 50 mM Lsg

25 1. Einführung Herstellung von 200 ml einer 1 M HCl Lsg. –M HCl = 36,5 g/mol –Konz. = 37% (w/v) –Dichte = 1,19 –37%ige HCl ist 12,06 molar –16,6 ml 37%ige HCl auf 200 ml

26 1. Einführung Herstellung von 10 ml einer 10%igen (w/v) Fleischextrakt Lsg. –1 g FE auf 10 ml A.dest. Herstellung von molaren Lsgen (exakt) immer im Messkolben (z.B. 50 mM KH 2 PO 4, 1 M HCl) %-Lsgen (w/v, v/v) normalerweise auch im Messkolben (ABER: Fragestellung beachten!!!)

27 2. Sterilisation und Keimreduktion Mos sind ubiquitär Arbeitsgeräte müssen frei von allen lebenden bzw. vermehrungsfähigen Mos (steril) sein Nährmedien müssen steril sein Kontaminationen (Einschleppung von unerwünschten Mos) müssen ferngehalten werden = steriles Arbeiten

28 2. Sterilisation und Keimreduktion Def. steril bzw. keimfrei: –Def.: frei von vermehrungsfreien Mos frei von Ruhestadien und Dauerformen (z. B. Sporen) Def. Sterilisation: –Beseitigung und/oder Abtötung aller Mos –Inaktivierung von Viren –die abgetöteten Keime verbleiben im Medium Def. Desinfektion: –selektive Abtötung bzw. irreversible Inaktivierung aller krankheitserregender Keime an und in kontaminierten Objekten steril/ teilweise steril/ unsteril

29 2. Sterilisation und Keimreduktion beruht v.a. auf der Denaturierung von Proteinen (Zellproteinen) bei trockener Hitze auf der Oxidation intrazellulärer Bestandteile Mos verschieden anfällig für beide Varianten Wirkung abhängig von: –Art des Mos –Alter –Zustand (vegetative Zelle oder Spore) –Umwelt- bzw. Milieubedingungen (Nährstoffe, pH,…) –Ausgangskeimzahl –ABER NICHT von: Form der Mo, Größe, NS, … 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

30 2. Sterilisation und Keimreduktion Wirkungsgradevaluation durch D-Wert Bestimmung Def. D-Wert (dezimale Reduktionszeit) : –Zeit, die erforderlich ist, um unter genau festgelegten Bedingungen die Ausgangskeimzahl um eine Zehnerpotenz (d.h. um 90%) zu reduzieren. vegetative Zellen werden durch Hitze relativ leicht abgetötet Endosporenbildner (Bacillus, Clostridium) hitzeresistent Bei der Arbeit mit gemischten Populationen muss immer von den resistentesten Formen ausgegangen werden 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

31 2. Sterilisation und Keimreduktion Dampfsterilisation (Autoklavieren) Autoklavieren –sicherste Sterilisationsmethode –Einwirkung von gespanntem, gesättigtem Wasserdampf –Normalerweise 121 °C, 2 bar Dampfdruck –Angaben für die notwendige Autoklavierzeit schwanken zwischen 10 bis 15 min, 15 min, und 20 min –Autoklavierzeit vom Medium abhängig (Empfindlichkeit), wenn möglich immer 20 min –ergo: Mindestautoklavierzeit 20 min –Häufig Medientemperatursteuerung –Aufheiz- und Abkühlzeiten beachten (tw. bis 1 – 1,5 Stunden) –Autoklaven-abhängig: verschiedene Programme: Müll, Flüssigkeiten, Geräte 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

32 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

33 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

34 2. Sterilisation und Keimreduktion Autoklaventypen: –Vertikalautoklaven (Standgeräte) mit 60 bis 200 l –Topfautoklaven 10 bis 40 l –Horizontalautoklaven 10 bis 1000 l Verlauf der Dampfsterilisation: –Aufheizzeit –Steigzeit –Ausgleichzeit (Temperaturfühler in Referenzgefäß) –Sterilisierzeit (i.d.R. 20 min) –Abkühlzeit 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

35 2. Sterilisation und Keimreduktion Kontrolle der Dampfsterilisation –chemische Indikatoren: funktionieren meist über Thermoindikatoren, die man auf das Sterilgut aufklebt; mittels Verfärbung kann man das Einwirken einer bestimmten Temp. ablesen (nicht aber die EW Zeit) –Bioindikatoren: meist Sporenstreifen in Ampullen, die an der kältesten Stelle im Autoklaven (hinten unten) angebracht werden und nach der Sterilisation in eine Nährlsg. unter sterilen Bedingungen überführt werden Abtötung durch feuchte Hitze

36 2. Sterilisation und Keimreduktion Tyndallisieren fraktionierte Sterilisation genannt mehrfaches (3x) Erhitzen auf 80 bis 100 °C meist im Wassertopf – Aufbewahrung bei Raumtemp. – Auskeimen von Endosporen – erneutes Erhitzen umständlich, zeitraubend zweifelhafter Erfolg 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

37 2. Sterilisation und Keimreduktion Kochen, strömender Dampf zur Teilentkeimung (Desinfektionsverfahren) Einwirkung von 100 °C z.B. 5 minütiges Kochen von Gerätschaften z.B. 30 minütiges Kochen von NL: es werden nur vegetative Zellen abgetötet, keine Endosporen beispielsweise für die Herstellung von Kulturmedien für Anaerobier verwendet 2.1. Abtötung durch feuchte Hitze

38 2. Sterilisation und Keimreduktion trockene Luft ist ein schlechter Hitzeleiter Nachteile: –bei trockener Hitze sind deutlich längere Einwirkzeiten und höhere Temperaturen notwendig –nur begrenzt einsetzbar: nicht für Flüssigkeiten Vorteile: –einfach –unaufwändig –keine nachträgliche Trocknung notwendig 2.2. Abtötung durch trockene Hitze

39 2. Sterilisation und Keimreduktion Heißluftsterilisation Temp./Zeit: –160 °C 180 min –170 °C120 min –180 °C 30 min Einpacken in Alufolie geeignet für: –Geräte aus Metall –Glaswaren –Gegenstände, die keine Feuchtigkeit vertragen 2.2. Abtötung durch trockene Hitze

40 2. Sterilisation und Keimreduktion 2.2. Abtötung durch trockene Hitze

41 2. Sterilisation und Keimreduktion Kontrolle: –durch chemische Indikatoren (Thermoindikatoren) –durch Bioindikatoren –als Teststreifen oder Indikatorbänder 2.2. Abtötung durch trockene Hitze


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