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Praktikum: Nachweis einer gentechnischen Veränderung in Lebensmitteln durch PCR.

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Präsentation zum Thema: "Praktikum: Nachweis einer gentechnischen Veränderung in Lebensmitteln durch PCR."—  Präsentation transkript:

1 Praktikum: Nachweis einer gentechnischen Veränderung in Lebensmitteln durch PCR

2 Vorbereitung Lehrer Für jede Arbeitsgruppe werden 550 µl InstaGene-Matrix aliquotiert! Das Tube wird mit IG beschriftet! Vorbereitung Lehrer

3 I. DNA-Extraktion 1. Vorbereitung 1.1 Beschriften Sie 2 Schraub- tubes mit: - non GMO (-GMO) - Lebensmittelprobe (T) und Ihrer Gruppennummer!

4 I. DNA-Extraktion 1.2 Pipettieren Sie jeweils 250 μl der durch Auf- und Abpipettieren homogenisierten InstaGene-Matrix aus Ihrem Vorratstube (IG mit 550 µl Gesamtvolumen) in die beiden beschrifteten Tubes! Überstand Beide Tubes sollten etwa die gleiche Menge InstaGene-Perlen enthalten!

5 I. DNA-Extraktion 2.1Wiegen Sie 1 g des nicht gen- technisch veränderten Lebens- mittels (-GMO) ab und geben Sie es in einen Mörser! 2.2Pipettieren Sie 5 ml H 2 O dest. hinzu! 2. DNA-Extraktion aus nicht GV-Lebensmitteln (-GMO)

6 I. DNA-Extraktion 2.3Homogenisieren Sie das Gemisch etwa 5 Minuten! 2.4Pipettieren Sie weitere 5 ml H 2 O dest. hinzu und zermörsern Sie weiter, bis ein pipettierbarer Brei entstanden ist!

7 I. DNA-Extraktion 2.5Pipettieren Sie 25 μl des Lebens- mittelbreis in das mit -GMO beschriftete Schraubtube (Inhalt des Schraubtubes 250 µl InstaGene)! 2.6Verschließen Sie das Tube und durchmischen Sie durch Anschnippen!

8 Um Kontamination mit +GMO-DNA zu vermeiden, wurde zuerst das -GMO-Material extrahiert! Die Reinigung von Mörser und Pistill erfolgt mit einem Detergenz z.B. Pril. Danach wird mit H 2 O dest. nachgespült.

9 3.DNA-Extraktion aus zu testendem Lebensmittel (T) 3.1Wiegen Sie 1 g des zu testenden Lebensmittels (T) ab und geben Sie es in einen Mörser! 3.2Pipettieren Sie 5 ml H 2 O dest. hinzu! I. DNA-Extraktion

10 3.3Homogenisieren Sie das Gemisch etwa 5 Minuten! 3.4Pipettieren Sie weitere 5 ml H 2 O dest. hinzu und zermörsern Sie weiter, bis ein pipettierbarer Brei entstanden ist! I. DNA-Extraktion

11 3.5Pipettieren Sie 25 μl des Lebensmittelbreis in das mit ("T") beschriftete Schraubtube (dieses enthält bereits 250 µl InstaGene)! 3.6Verschließen Sie das Tube und durch- mischen Sie durch Anschnippen! I. DNA-Extraktion

12 Reinigen Sie den Mörser und Pistill mit einem Detergenz! Reinigung

13 4.Enzymdenaturierung bei 95°C 4.1 Inkubieren Sie die beiden Schraubtubes 5 Minuten bei 95°C im Wasserbad! 4.2Zentrifugieren Sie die Tubes 5 Minuten bei Umdrehungen pro Minute! I. DNA-Extraktion 95 o C

14 Beachten Sie: Bei der Entnahme der Kontroll-DNA (-GMO) und der DNA der Lebensmittelproben (T) aus den Schraubtubes darf nur der Überstand ohne InstaGene- Perlen entnommen werden!

15 Bedeutung der InstaGene-Matrix InstaGene-Matrix ist negativ geladen bindet vorhandene Kationen Kationen dienen als Cofaktoren von Enzymen, wie z. B. der DNasen DNasen werden nicht aktiviert DNA-Abbau wird verhindert Aber: InstaGene-Matrix bindet Mg 2+ -Ionen und hemmt damit die Polymerase bei der PCR

16 Aufbewahrung der Proben Die Tubes können im Kühlschrank (bei 8 o C mit der Matrix) über Tage aufbewahrt werden!

17 Entnahme des Überstandes 4.3Überführen Sie jeweils 50 µl des Überstandes aus Ihren Tubes in zwei neue, zuvor entsprechend beschriftete Tubes (–GMO, T)! I. DNA-Extraktion

18 Ansetzen des PCR-Master-Mix Gebrauchsfertiges Gemisch aus PCR-Master-Mix mit Primern darf bis zum Start der PCR nicht länger als 30 Min. auf Eis stehen! Innerhalb dieser 30 Min. müssen alle Proben für die PCR angesetzt sein! Eis richten! Zu beachten ist:

19 Achtung!!! Nach dem Auftauen: der Taq-Polymerase und des Master Mix die Tubes vor dem Öffnen zentrifugieren!

20 Zusammensetzung PCR-Master-Mix 100 mM KCl 20 mM Tris-HCl 2 mM dNTP (ATP, GTP, CTP, TTP) 4 mM MgCl 2 1 µM Primer 0.35 µl Taq-Polymerase

21 Ansetzen des Molekulargewichts- Standards durch den Lehrer Pipettieren Sie 30 µl Orange-D-Loading- Dye zum Molekulargewichts-Standard! Tube auf Eis stellen!

22 Aliquotieren des PCR-Master-Mix durch den Lehrer Jeweils 300 µl PCR-Master-Mix werden zu den Plant Primern (6 µl) und GMO Primern (6 µl) pipettiert! Tubes auf Eis stellen!

23 Vorbereitung: PCR und Elektrophorese in Gruppenarbeit (20`) Jede Arbeitsgruppe bereitet für alle weiteren Gruppen entsprechend Ihrem Arbeitsauftrag einen Teil der PCR oder der Elektrophorese vor. Arbeits- aufträge

24 Tubes pro Arbeitsgruppe nach der Gruppenarbeit +GVO -GVLT GMM PMM LD MWR 6 PCR-Tubes

25 Ansetzen und Durchführung der PCR (200`) 1. Nummerierung der PCR-Tubes 1.1 Nummerieren Sie Ihre PCR-Tubes 1 - 6!

26 Nr.Master MixDNA µl PMM 10 µl GMM 10 µl –GVL (Kontrolle) µl PMM 10 µl GMM 10 µl Lebensmittelprobe (T) µl PMM 10 µl GMM 10 µl +GVL (Kontrolle) 1.2Pipettieren Sie die PCR-Ansätze nach folgender Tabelle! MM: Mastermix; GVL: gentechnisch verändertes Lebensmittel

27 1.3Durchmischen Sie ihre PCR-Ansätze durch Auf- und Abpipettieren! Zentrifugieren Sie Ihre PCR-Ansätze falls notwendig 1 Minute bei 1000 Umdrehungen! 1.4Kühlen Sie Ihre PCR-Ansätze im Eis bis zum Beginn der PCR! III. Ansetzen und Durchführung der PCR

28 - Um Verwechslungen zu vermeiden tragen Sie die Position Ihrer Proben im Thermocycler auf dem Übersichtsblatt ein! III. Ansetzen und Durchführung der PCR - Tubes müssen gut verschlossen sein! Über- sichts- blatt

29 2.Durchführung der PCR Führen Sie die PCR entsprechend dem Temperaturprogramm am Thermocycler durch! III. Ansetzen und Durchführung der PCR Cycler- Programm

30 DNA-Amplifikation Cycler- Programmierung 40 Zyklen 10`, 72 °C Completing 120``, 94°C Denaturation 60``, 94 °C Denaturation 60``, 59 °C Annealing 120``, 72 °C Elongation

31 Durchführen der PCR Cycler-Programmierung: Denaturieren94 o C 2 Min. 40 Zyklen: Denaturieren94 o C 1 Min. Primeranlagerung59 o C 1 Min. DNA-Neusynthese72 o C 2 Min. Vervollständigung der neuen Stränge: 72 o C 10 Min. Dauer: ca. 3 Stunden

32 Nach der Amplifizierung können die Proben bei – 20 o C im Eisfach oder über Nacht bei 4 o C im Cycler bis zur Gelelektrophorese aufbewahrt werden. Ende der PCR

33 1.Führen Sie den Nachweis der PCR-Produkte entsprechend Ihres Arbeitsauftrages als Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese durch! 2.Färben Sie Ihre Gele entsprechend Ihres Arbeits- auftrages und werten Sie diese aus! Arbeitsgruppe Arbeitsgruppe IV.Nachweis der PCR–Produkte durch Elektrophorese (Agarose/PAGE) Agarose- Gelelektro- phorese PAGE Befüllen des Gels


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