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ENZYME Teil 1: Grundlagen und Substratbestimmungen.

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1 ENZYME Teil 1: Grundlagen und Substratbestimmungen

2 Metastabiler Zustand Beispiel: Glucose-6-Phosphat + H 2 OGlucose + Pi [Glc6P] [H 2 0] [Glc] [Pi] K = = x  Gleichgewicht stark auf Seite von Glc + Pi  G o ‘ = kcal mol -1 (Exergonische Reaktion)  Reaktion läuft freiwillig ab! ABER: Beim Lösen von Glc6P in Wasser passiert aber scheinbar nichts!

3 Vorrausetzungen für den Ablauf einer Reaktion Zusammenstoß der Moleküle: Räumlich richtig ! Energiereich genug ! 25 °C notwendige Energie Aktivierungsenergie die Energie, die man einem System zuführen muß, damit die Reaktion messbar schnell abläuft Energiezufuhr (Temperaturer- höhung) steigert die Reaktions- geschwindigkeit ! 75 °C

4 Energieprofil (unkatalysierte Reaktion) GHGH GR GR G G A+ B C+ D Aktivierungsenergie

5 Energieprofil (enzymkatalysierte Reaktion) GHGH E+C+D E+A+B GR GR G G E A B E C D A+B+E  EAB  ECD  C+D+E EAB = Enzym-Substrat Komplex ECD = Enzym-Produkt Komplex

6 Enzymkatalysierte Reaktionen benötigen geringere Aktivierungsenergie, weil: Näherungseffekt räumlich richtige Ausrichtung der Substrate durch Bindung an Enzym Milieueffekt optimale Bedingungen für Reaktion am Enzym (pH, Solvatisierung, etc) Konformationsstreckungseffekt durch Substratbindung Gestaltänderung des Enzyms (Übergangszustand)

7 Enzymkatalysierte Reaktionen Gleichgewicht Ein Enzym verändert die Geschwindigkeit einer Reaktion in Richtung des Gleichgewichts. Das Gleichgewicht selbst kann aber nicht verändert werden! Wenn das Gleichgewicht einer Reaktion stark auf einer Seite liegt spricht man von einer nicht umkehrbaren Reaktion. Hin- und Rückreaktion Ein Enzym kann eine Reaktion in beide Richtungen beschleunigen. Die Reaktion läuft aber immer in Richtung Gleichgewicht ab.

8 Was sind Enzyme Enzyme sind Biokatalysatoren, die die Aktivierungs- energie einer Reaktion herabsetzen können! Unterschiede zu anderen Katalysatoren sind: Spezifität für die Substrate (Gruppen) und Reaktionen Kapazität sehr hohe Effizienz (Beschleunigung bis zu fach) Regulation Aktivität kann an Umweltbedingungen angepasst werden.

9 Regulation von Enzymen Proteinsynthese und Proteinabbau Neusynthese des gewünschten Enzyms; Aktivierung oder Deaktivierung von Genen Konformationsänderung (a) Allosterische Effekte Effektoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) binden an regulatorisches Zentrum des Proteins

10 Allosterische Effekte InhibitorAktivator Enzym inaktiv Enzym aktiv

11 Regulation von Enzymen Proteinsynthese und Proteinabbau Neusynthese des gewünschten Enzyms; Aktivierung oder Deaktivierung von Genen Konformationsänderung (a) Allosterische Effekte Effektoren (Inhibitoren oder Aktivatoren) binden an regulatorisches Zentrum des Proteins (b) Kompetitive Hemmung „Konkurrenz“ um das aktive Zentrum Chemische Veränderung Phosphorylierungen (Protein-Kinasen) oder Dephosphorylierungen (Phosphatasen)

12 Einteilung von Enzymen 1.Oxidoreduktasen Transfer von H, O oder e - von einem Substrat auf ein anderes 2.Transferasen Transfer von chem. Gruppen zwischen Substraten 3.Hydrolasen hydrolytischer Abbau 4.Lyasen nicht-hydrolytische Spaltung von Bindungen 5.Isomerasen Intramolekulare Umlagerungen 6.Ligasen Knüpfung von kovalenten Bindungen unter ATP-Verbrauch

13 Benennung von Enzymen Beispiel: Fructose + NADP +  5-Anhydro-D-Fruktose + NADPH + H + Bezeichnung Fructose 5-Dehydrogenase Fructose:NADP 5-Oxidoreduktase Einteilung EC-Nummer, hier EC (Oxidoreduktase, wirkt an CH-OH Donoren, NAD oder NADP als Akzeptor, Enzymnummer)

14 Analytisches Arbeiten mit Enzymen 1.Enzymbestimmung Bestimmung der Biologische Aktivität  Bestimmung der Enzymaktivität Daneben kann auch der Proteingehalt bestimmt werden (z.B. mit Immunologischen Methoden) 2. Substratbestimmung Bestimmung eines Analyten (eines Substrates) mit Hilfe eines Enzyms Das Enzym muß dazu aber käuflich erhältlich sein, oder selbst gereinigt werden.

15 Enzymreaktionen

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17 Enzymatische Substratbestimmung 1.Spezifisches Enzym Enzym sollte nur das Substrat umsetzen 2.Co-Substrate wo notwendig muß man Co-Substrate (Co-Enzyme) einsetzen 3.Reaktionsmilieu pH-Wert, Pufferung, Aktivatoren, etc 4. Detektionsmöglichkeit (a) Direkte Messung mittels Extinktion Produkt absorbiert, Substrat nicht (oder umgekehrt); Co-Substrat oder Co-Produkt absorbiert (b) Produktnachweis chemisch 5.Abfangreaktionen sind notwendig wenn das Gleichgewicht ungünstig liegt. Aufbau eines Testsystems

18 Das NAD(P)H-System Die reduzierte Form des Co-Substrats NADH oder NADPH absorbiert Licht im UV-Bereich bei 340 nm. Die oxidierte Form NAD + oder NADP + aber nicht. Universell mit Oxido- reduktasen anwendbar!

19 Bespiel: Sorbitbestimmung D-Sorbit + NAD + D-Fruktose + NADH + H + SDH Probe + NAD + SDH  E (NADH)

20 Allgemeine Überlegungen 1 Vorraussetzungen Gleichgewicht der Reaktion liegt auf Seite von C +D [Cosubstrat] > [Analyt] sonst kann nicht alles an Probe verbraucht werden A + B C + D

21 Allgemeine Überlegungen 2 Steigung = Geschwindigkeit Regeln v nimmt ab, wenn [c] kleiner wird. Wenn A+B mit C+D im Gleichgewicht, dann v = 0 (kein Netto-Umsatz) Konzentration (Aktivität) des Enzyms ändert v, hat aber keinen Einfluß auf den Endpunkt (  E bleibt gleich) A + B C + D

22 Bestimmung von Glu & Frc 1.Glukose + ATP Glukose-6-P + ADP Reaktion nicht umkehrbar (vollständig) Auch Fruktose wird umgesetzt 2.Glu-6-P + NADP + Glukonat-6P + NADPH + H + Indikatorreaktion 3.Fructose-6-P Glucose-6-P Zusatzreaktion HK G6PDH PGI E t HK GDH PGI Frc Glu

23 ENZYME Teil 2: Enzymkinetik & Enzymaktivitäts- und Proteinbestimmung

24 Kinetik unkatalysierte Reaktion Wenn [S] >> [P] z.B. Hydrolyse von Saccharose in saurer Lösung (  ) S  P (  )

25 Kinetik unkatalysierte Reaktion Umformung der Grafik: Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion gegen die Substratkonzentration linearer Zusammenhang !! v = -d[S] dt -1 = k x [S] k....Geschwindigkeitskonstante

26 Kinetik unkatalysierte Reaktion bimolekulare Reaktion (  ) A + B  C + D (  ) (  ) v = -d[A] dt -1 = -d[B] dt -1 = k x [A] [B]

27 Enzymkinetik enzymkatalysierte Reaktion Sättigungsbereich linearer Bereich v prop. [S] Ursache der Sättigungskinetik ?? Anfangsgeschwindigkeit in Abhängigkeit der Substratkonzentration

28 Ursachen der Sättigung bei enzymkatalysierten Reaktionen ?? E + S  ES  EP  E + P Wenn [S] >> [E] sind alle Enzymmoleküle mit Substrat besetzt und eine höhere Umsetzungsrate v ist nicht möglich # SÄTTIGUNGSKINETIK #

29 Michaelis-Menten-Gleichung v = v max. [S] K M + [S] Sonderfall 1Hohe Substratkonzentration [S] >> K M  K M + [S] ~ [S] die Gleichung geht über in v = v max Sättigung - v unabhängig von [S] v max. [S] K M v max K M Sonderfall 2Niedrige Substratkonzentration [S] << K M  K M + [S] ~ K M v = =.[S] Linearität - linearer Anstieg von v mit Zunahme von [S]

30 Ermittlung des Zahlenwertes K M v = = = v max. [S] [S] + [S] v max. [S] 2 [S] v max 2 bei v max /2 ist die Substratkonzentration gleich K M  großer Zahlenwert für K M heißt lockere Bindung von Substrat an das Enzym:geringe Affinität  kleiner Zahlenwert für KM heißt feste Bindung von Substrat an das Enzymhohe Affinität [S] = K M

31 Berechnung des K M -Wertes eines Enzyms V max KmKm

32 Lineweaver-Burke-Plot doppelt reziproke Auftragung von v und [S] 1/v max 1/K M v max ausschlaggebend für die maximale Geschwindig- keit ist die Menge an Enzym K M Eigenschaft des Enzyms, die auch ohne Enzymreinigung bestimmt werden kann

33 Verhalten verschiedener Isoenzyme gleicher v max bei verschiedenen Substrataffinitäten

34 Enzymaktivitätsbestimmung Enzymextraktion Welche Faktoren beeinflussen bzw. beeinträchtigen die Enzymaktivität? Abhilfen gegen diese Interferenzen ?? Destruktive Einflüsse > Schwermetalle > Sauerstoff > Phenole und Gerbstoffe > Temperatur > pH-Wert > Proteasen Regulative Einflüsse > wie Inhibitoren oder Aktivatoren

35 Schwermetalle >> Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA, Na + Salz) Komplexierungsreagens (Chelator) mit hoher Affinität zu Schwermetallen, Calcium, Magnesium nicht für alle Enzyme einsetzbar (Metallkofaktoren) Oxidierendes Milieu >> Dithiothreit (DTT) Problem der Disulfidbrückenbildung im Enzymprotein Zusatz von Stoffen mit frei verfügbaren SH-Gruppen (Sulfhydryl-Gruppen), die leicht oxidierbar sind -SH HS- + 1/2 O 2 -> -S-S- + H 2 O

36 Phenole/Gerbstoffe >> Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) Phenole bilden mit Proteinen sehr starke H-Brücken aus Phenoloxidasen oxidieren Phenole zu Quinonen, die mit Proteinen polymerisieren PVPP bildet ebenfalls starke H-Brücken mit Phenolen aus zusätzlich Schaffung reduzierender Bedingungen (DTT, Ascorbinsäure) gegen Phenoloxidasen Temperatur >> Arbeiten bei +4°C Enzymaktivität ist von Erhalt der aktiven Proteinkonformation abhängig basiert auf hydrophoben Wechselwirkungen im Inneren, die bei höheren Temperaturen reduziert werden Proteasen

37 pH-Wert >> Pufferung der Medien Verwendung (an)organischer Puffer (Acetat, Phosphat) enzymkompatibler, organischer Puffer (sg. Good`sche Puffer) wie Tris, HEPES etc. gegen die Säuredenaturierung Proteasen >> Proteaseinhibitoren (Cocktails) MetalloproteasenEDTA, EGTA SerinproteasenPhenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Benzamidin Saure ProteasenPepstatin A ThiolproteasenLeupeptin, Antipain

38 Enzymaktivitätsbestimmung Weitere Aufreinigung # Filtration (Cheesecloth, Miracloth) # Abzentrifugieren # reversible Fällungen (Ammoniumsulfat, Protaminsulfat) # Gelfiltration Abtrennung störender niedermolekularer Verbindungen Pufferaustausch # Ultrafiltration (Extraktkonzentrierung)

39 Proteinbestimmung UV-Absorptionsmethoden >> Proteine absorbieren im UV mit 2 Maxima, bei 200 und 280 nm. Probleme Verfälschung durch DNA/ RNA in diesem Bereich >> 2-Wellenlängenmessung >> Die Extinktion einer 0.1% Proteinlösung ist bei 280 nm, bzw. 45 bei 200 nm. Interferenzen durch UV-absor- bierende Substanzen sowie Additiva und pflanzliche Inhaltsstoffe nicht denaturierend

40 Proteinbestimmung nach Lowry et al. (1951) >> Unter alkalinen Bedingungen komplexieren Cu 2+ -Ionen mit Peptid- bindungen und werden zu Cu + reduziert. >> Das Folin-Reagens enthält Phosphomolybdat-Wolframat Mischsäuren, die durch Protein-Cu + -Komplexe [sowie phenolische Seitengruppen von Tyr/Trp, und Cys] zu blauen Mischoxiden reduziert werden z.B. 3H 2 O. P 2 O 5. 13WO 3. 5MoO 3. 10H 2 O 3H 2 O. P 2 O 5. 14WO 3. 4MoO 3. 10H 2 O >> Vermessung bei 750 nm.

41 Proteinbestimmung nach Lowry et al. (1951) # Interferenzen durch Gerbstoffe und Additiva, durch Vorfällung mit Trichlor- essigsäure/Deoxycholat behebbar # hohe Sensitivität und Linearität für verschiedenste Proteine # höherer Zeit- und Arbeitsaufwand

42 Proteinbestimmung Bradford-Assay >> Protein-Farbstoffkomplex mit Coomassie Brilliant Blue G250 (Schafwollfärberei) >> im Basischen: anionische blaue Form (E max 595 nm) >> durch WW mit basischen und aromatischen Aminosäuren der Proteine auch im Sauren stabilisiert wird. >> CBB G250 ist ein synthetischer, amphoterer Farbstoff, der in saurer Lösung in der kationischen braunroten Leukoform vorliegt (E max 465 nm)

43 # variable Farbausbeute für verschiedene Proteine # einfach, rasch, sehr empfindlich # nur geringe Interferenzen mit Chemikalien Proteinbestimmung Bradford-Assay

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