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Biochemische Reaktionen. Gliederung 1. Einführung 1. Das Massenwirkungsgesetz 1. Enzyme 3.1 Enzymkinetik 3.2 Modelle 3.2.1 Gleichgewichtsapproximation.

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1 Biochemische Reaktionen

2 Gliederung 1. Einführung 1. Das Massenwirkungsgesetz 1. Enzyme 3.1 Enzymkinetik 3.2 Modelle Gleichgewichtsapproximation Quasi – Stationaritätsapproximation 3.3 Enzyminhibition kompetitive Inhibition allosterische Inhibition Kooperativität 3.4 Das Monod – Wyman – Modell 4.Glykolyse und Glykolytische Oszillation

3 1. Einführung audesapere.ch/homoeopathie/neuewegekrebs/neuewegekrebs.html - 37k -

4 Reaktionsgeschwindigkeit Die Geschwindigkeit, mit der eine reagierende Substanz verbraucht oder mit der ein Reaktionsprodukt gebildet wird Sie ist abhängig von: 1. Zahl der Zusammenstöße pro Zeiteinheit 2. Anteil mit ausreichender Kollisionsenergie 3. Anteil mit geeigneter Orientierung Geschwindigkeitskonstante – durch das Symbol k darstellbar – Stellt die Proportionalität der Reaktionsgeschwindigkeit v zu den Konzentrationen der Substrate dar – v = k 1 [A] Reaktion 1. Ordnung – v = k 2 [A][B] Reaktion 2. Ordnung – abhängig von der geometrischen Struktur und Größe der reagierenden Moleküle & der Temperatur Reaktionsrate Sie gibt an, wie oft die chemischen Reaktionen pro Zeiteinheit im Einheitsvolumen stattfinden: Sie ist somit proportional zur Anzahl der Zusammenstöße pro Zeiteinheit zwischen Edukten 1. Einführung

5 Reaktion 1. Ordnung A B die Reaktionsgeschwindigkeit ist proportional zur Konzentration von A Reaktion 2. Ordnung A + B C + D die Reaktionsgeschwindigkeit hängt von der Konzentration zweier Reaktionsteilnehmer abhängt 1. Einführung

6 2. Das Massenwirkungsgesetz A + B C Reaktionsrate: Massenwirkungsgesetz (MWG) Die Reaktionskonstante verdoppelt sich nicht zwingend mit der Verdoppelung der Konzentration eines Substrats d [ C ] dt d [ C ] = k [ A ][ B ] k

7 A + B C die Konzentrationsänderung von A für die Reaktion lautet: = k - [C] – k + [A][B] im Gleichgewichtszustand ändern sich die Konzentrationen nicht, es gilt: [C] eq = [A] eq [B] eq sind A und C an keinen weiteren Reaktionen beteiligt, so gilt [A] + [C] = A 0 (const.) [C] = A 0 K eq = k - /k + heißt Gleichgewichtskonstante 2. Das Massenwirkungsgesetz

8 K eq hat keine feste Einheit, sie richtet sich nach der jeweiligen Reaktionsgleichung K eq <<1 hohe Affinität zwischen A und B [B] = K eq : die Hälfte von A liegt in gebundener Form vor

9 2. Das Massenwirkungsgesetz Das MWG gilt für reversible Reaktionen, die den Gleichgewichtszustand erreicht haben. Es gibt den Zusammenhang zwischen den Aktivitäten der Edukte und der Produkte einer Reaktion im chemischen Gleichgewicht an.

10 3. Enzyme

11 3.1. Enzymkinetik Enzyme sind die am höchsten spezialisierten Proteine hochspezifisch Katalysatoren biologischer Reaktionen für sie gilt: sie arbeiten unter milden Bedingungen in wässrigen Lösungen sie helfen anderen Molekülen, sich in ein Produkt umzuwandeln, sie selbst verändern sich nicht Wichtigste Eigenschaften: Genauigkeit und katalytische Wirkung

12 Sie setzen die Aktivierungsenergie herab und beschleunigen so die Bildung des Produkts bis zu 10Mio mal schnellere Reaktionen Enzyme folgen nicht direkt dem MWG, die Reaktionsrate steigert sich mit der Enzymkonzentration nur in einem gewissen Umfang, bis die maximale Reaktionsgeschwindigkeit erreicht ist 3.1 Enzymkinetik

13 3.2. Modelle S + E C P + E Enzyme beschleunigen die Hin- und Rückreaktion Es gibt zwei ähnliche Arten, die Gleichung zu bestimmen – Die Gleichgewichtsapproximation (Michaelis und Menten) – Quasi – Steady – State Approximation (Briggs und Haldane) k 1 k -1 k2k2

14 s = [S], c = [C], e = [E] und p = [P] = k -1 c - k 1 se = (k -1 + k 2 )c – k 1 se = k 1 se – (k 2 + k -1 )c = k 2 c e + c = e Modelle

15 3.2.1 Die Gleichgewichtsapproximation S + E C P + E Annahme: das Substrat seht unmittelbar im Gleichgewicht mit dem Komplex k 1 se =k -1 c mit e + c = e 0 ergibt sich: (K s = k -1 /k 1 ) die Reaktionsrate ist gegeben durch V max = k 2 e 0 ist die max. Reaktionsgeschwindigkeit wird erreicht, wenn sich alle Enzyme mit dem Substrat S im Komplex befinden k1k1 k2k2 k -1

16 3.2.1 Die Gleichgewichtsapproximation bei s = K s hat die Reaktionsrate die Hälfte ihres Maximums erreicht Wichtig: die Gleichung k 1 se = k -1 c ist nicht immer gültig, denn nach der Gleichung = k -1 c - k 1 se würde das Substrat nicht verbraucht werden und kein Produkt entstehen

17 3.2.2 Quasi – Stationaritätsapproximation Annahme: die Bildung und der Zerfalls des Komplexes stehen zu jeder Zeit im Gleichgewicht dc/dt 0 Einführung dimensionsloser Variablen σ = x = τ = k 1 e 0 t κ = є = α = = -σ + x (σ +α) = σ – x (σ +κ)

18 = -σ + x(σ +α) = σ - x(σ +κ) = 0 = 0 II Quasi - Stationaritätsapproximation: die rechte Seite der Gleichung wird Null gesetzt Variable x ändert sich mit σ sie berücksichtigt: є ist klein und dx/dτ hat die Ordnung Die Quasi - Stationaritätsapproximation

19 Aus =0 folgen die DGL´s und Michaelis – Menten – Gesetz q = κ-α = Mit Hilfe der ursprünglichen Variablen: K m = Die Quasi - Stationaritätsapproximation

20 Quasi – Stationaritätszustand Gleichgewicht K m = ähnliche Form, Ergebnisse basieren jedoch auf unterschiedliche Annahmen (K s = k -1 /k 1 )

21 3.2. Modelle Michaelis – Menten – Gesetz ist eine brauchbare Approximation, wie das MWG nicht universell anwendbar K m ist relativ einfach zu bestimmen, denn kann geschrieben werden als 1/V ist eine lineare Funktion von 1/s.

22 3.2. Modelle Diese doppeltreziproke Auftragung wird Lineweaver – Burk – Plot genannt Sie werden experimentell bestimmt Man kann an ihnen V max und K m ablesen

23 3.2. Modelle Alternative Methode: der direkte lineare Graph, V max gegen K m Wiederholen des Versuchs mit diversen Anfangskonzentratione n und Geschwindigkeiten ergibt eine Familie von Geraden Idealfall: Schnittpunkt in einem einzelnen Punkt ?title=Datei:Enzymkinetik3.png&file timestamp=

24 3.3. Enzyminhibition Hemmt die katalytische Wirkung Allgemeine Eigenschaft von Enzymreaktion wichtig zur Kontrolle der Enzymaktivität irreversible Hemmstoffe oder katalytische Gifte: sie senken die Enzymaktivität auf 0 Das Enzymmolekül ist für gewöhnlich ein sehr langes Protein, meist weitaus länger als das Substratmolekül, dessen Reaktion katalysiert wird

25 3.3. Enzyminhibition Im Enzym eingebunden sind ein oder mehr aktive Zentren, an die sich das Substrat binden kann, um einen Komplex zu bilden Allgemein katalysiert ein Enzym ein Substratmolekül ähnlicher Struktur (Schlüssel- Schloss-Prinzip) Gibt es ein dem Substrat ähnliches Molekül, kann dieses ebenfalls an die aktive Seite gebunden werden und so die Bindung des Substratmoleküls verhindern und die Reaktion hemmen

26 kompetitiver Hemmstoff: der Hemmstoff wetteifert mit dem Substrat um die aktive Seite 3.3. Enzyminhibition

27 Das Enzym hat häufig andere bindende Seiten, die sich von der aktiven Seite unterscheiden - allosterische Seite sie unterscheiden sich strukturell von der katalytisch aktiven Seite regulierende Seiten, da die katalytische Aktivität durch Bindung an diese Seite reguliert wird Effektor (Modifier):der Liganden, der an die allosterische Seite gebunden ist Der Effektor heißt allosterischer Aktivator, wenn er die katalytische Wirkung steigert und allosterischer Inhibitor, wenn er die Aktivität des Substrats mindert 3.3. Enzyminhibition

28 3.3.1 Kompetitive Inhibition Einfachstes Beispiel: die Reaktion wird gestoppt, wenn der Inhibitor an die aktive Seite des Enzyms gebunden ist S + E C 1 E + P E + I C 2 Mit Hilfe des MWG = -k 1 se + k -1 c 1 = -k 3 ie + k -3 c 2 = k 1 se – (k -1 + k 2 )c = k 3 ie – k -3 c 2 e + c 1 + c 2 = e 0 k1k1 k2k2 k-1k-1 k3k3 k -3

29 Im Quasi-stationären Zustand für die Reaktionsgeschwindigkeit ergibt sich Der Effekt des Inhibitors ist es, die effektive Gleichgewichtskonstante des Enzyms durch den Faktor 1+i/K i zu steigern die Reaktionsgeschwindigkeit nimmt ab

30 Falls der Inhibitor sich an die allosterische Seite binden kann, ergibt sich die Möglichkeit, dass das Enzym den Inhibitor und das Substrat gemeinsam binden vier mögliche Bindungsarten für das Enzym und Übergänge zwischen ihnen E ESE + P EIEIS Allosterische Inhibition k1sk1s k2k2 k -1 k -3 k3ik3i k -1 k3ik3ik -3 k1sk1s

31 3.3. Enzyminhibition Die einfachste Analyse ist die Gleichgewichtsanalyse definiere und x, y, z beschreiben die Konzentrationen von ES, EI und EIS Aus dem MWG folgt für den stationären Zustand lineares Gleichungssystem

32 3.3. Enzyminhibition Wir können x, y, z als Funktionen von i und s bestimmen mit V max = k 2 e 0 ist der allosterische Inhibitor mindert die maximale Reaktionsgeschwindigkeit, während K s unverändert bleibt

33 3.3.3 Kooperativität Ein Enzym kann mehr als ein Substratmolekül binden Bindung eines Substratmoleküls beeinflusst die Bindung des nachfolgenden Annahme:ein Enzym kann zwei Substratmoleküle binden es kann in einem von drei Stati existieren Als freies Molekül E Als Komplex mit einem besetzten Center C 1 Als Komplex mit zwei besetzten Center C 2 S + E C 1 E + P S + C 1 C 2 C 1 + P k1k1 k2k2 k -1 k3k3 k4k4 k -3

34 3.3.3 Kooperativität Das MWG angewandt, kann man die Gleichungen für die 5 Konzentrationen von S, E, C 1, C 2 und P aufschreiben

35 Wir übernehmen die Annahme des Quasi-stationären Zustands: dc 1 /dt = dc 2 /dt = 0 Für die Reaktionsgeschwindigkeit ergibt sich Kooperation

36 Die aktiven Seiten handeln unabhängig und identisch voneinander k 1 = 2k 3 = 2k +, 2k -1 = k -3 = 2k - und 2k 2 = k 4 Für die Reaktionsgeschwindigkeit ergibt sich

37 Die Bindung des ersten Substratmoleküls erfolgt langsam, die zweite sehr schnell (große positive Kooperativität) k 3 und k 1 0, k 1 k 3 = const. K 1 und K 2 0, K 1 K 2 =const. K m ² = K 1 K 2 und V max = k 4 e 0 i.A. gibt es n Gleichgewichtskonstaten, wenn n Substratmoleküle an das Enzym gebunden sind K 1 und K n 0, K 1 K n = const. wobei K m n = Diese Gleichung ist bekannt als Hill – Gleichung Kooperation

38 es gilt das Hill – Diagramm sollte eine Gerade mit der Steigung n ergeben es ist nicht ungewöhnlich, dass n nicht ganzzahlig ist Kooperation

39 ein Enzym kann negative Kooperativität aufweisen k 3 wird herabgesetzt

40 3.4. Das Monod – Wyman – Changeux Modell das Modell basiert auf folgende Annahmen: kooperative Proteine sind zusammengesetzt aus diversen identischen Reaktionseinheiten, genannt Protomer, die die gleichen Positionen im Protein belegen jedes Protomer umfasst eine bindende Seite für jeden Liganden die bindenden Seiten innerhalb jeden Proteins sind äquivalent falls die Bindung eines Linganden zu einem Protomer einen konformativen Wechsel im dem Protomer einleitet, wird ein identischer konformativer Wechsel in allen Proteinen eingeleitet das Protein hat zwei konformative Stati, gewöhnlich bezeichnet als R und T, die sich in ihrem Verhalten Liganden zu binden unterscheiden

41 wir betrachten Protein, mit nur zwei binden Seiten es kann in einem von 6 Stati existieren: R i, i= 0, 1, 2 oder T i, i= 0, 1, 2 der Einfachheit halber: R i kann nicht in T i umgerechnet werden Die Stati für das Protein und die zugelassenen Übergänge 3.4. Das Monod – Wyman – Changeux - Modell

42 es gilt r i und t i sind die entsprechenden Konzentrationen von R i und T i für die Sättigungsfunktion gilt: mit K i = k -i /k i, i=1, 2, 3 ergibt sich durch Substitution erhält man wobei r 0 /t 0 = K Das Monod – Wyman – Changeux - Modell

43 Allgemein ist Y eine sigmoidale Funktion von s K 3 = das Substrat kann nicht direkt an die T- Konformation binden K 2 = nur die R – Konformation existiert Michaelis – Menten Gleichung

44 4. Glykolyse und glykolytische Oszillation Stoffwechsel kann als Austausch freier Energie gesehen werden Stoffwechselwege: die durch Enzyme katalysierten Auf-/Ab- und Umbauprozesse in den Zellen bekannter Träger von Energie in der Zelle: ATP Adenosintiphosphat

45 4. Glykolyse und glykolytische Oszillation Die Bindungen der drei Phosphate sind sehr energiereich Werden die Phosphoanhydrid-Bindungen durch Enzyme hydrolytisch gespalten, entsteht das Adenosindiphosphat (ADP) bzw. das Adenosinmonophosphat (AMP) und Phosphat es werden jeweils etwa 32,3 kJ/mol (Spaltung einer Bindung) oder 64,6 kJ/mol (Spaltung beider Bindungen) Energie frei. Die freiwerdende Energie ermöglicht die Arbeitsleistungen in den Zellen.

46 katalysiert vom Enzym PFK1 Isomerisierung

47 4. Glykolyse und glykolytische Oszillation PFK 1 wird von ATP allosterisch gehemmt allosterisches Enzym ATP kann Substrat und allosterischer Hemmstoff sein der Inhibitoranteil von ATP wird durch AMP beseitigt Aktivität von PFK1 steigt, wenn ATP/AMP sinkt 2ADP ATP + AMP ei:Phosphofructokinase.png&filetimestamp=

48 4. Glykolyse und glykolytische Oszillation ein Überfluss an Fructose 6-Phosphat führt zur Bildung von Fructose-2,6-bisphosphat Aktivität von PFK1 wächst negative Rückkopplung PFK1- Aktivität wird von einem komplexen System von Reaktionen kontrolliert

49 4. Glykolyse und glykolytische Oszillation unter gewissen Umständen ist bekannt: die Rate der Glykolyse ist periodisch, manchmal sogar chaotisch ein mathematisches Modell von Sel´kov (1968), später modifiziert von Goldbeter und Lefever (1972) Achtung: nur die positive Rückkopplung von ADP auf PFK1 wird beachtet

50 4.1. Modell von Sel´kov PFK1 ist inaktiv im ungebundenen Status aktiviert durch die Bindung mit ADP-Molekülen im aktiven Status katalysiert das Enzym die Produktion von ADP aus ATP das Modell: PFK1 (E) ist aktiviert oder deaktiviert, je nach Bindungsstatus mit den γ-Molekülen von ADP (S 2 ) γS 2 + E ES 2 γ ATP (S 1 ) kann sich an die aktivierte Form des Enzyms binden um ein Produkt von ADP zu bilden Annahme: die Rate von S 1 ist beständig, das Produkt S 2 wird jedoch irreversibel verbraucht

51 4.1. Modell von Sel´kov S 1 S 1 + ES 2 γ S 1 ES 2 γ ES 2 γ + S 2 S 2 k1k1 k -1 ν1ν1 k2k2

52 4.1. Modell von Sel´kov s 1 = [S 1 ], s 2 = [S 2 ], e = [E], x 1 = [ES 2 ν ], x 2 = [S 1 ES 2 γ ] e + x 1 + x 2 = e 0

53 4.1. Modell von Sel´kov es ergibt sich mit

54 4.1. Modell von Sel´kov Annahme: є ist klein u 1 und u 2 sind fest und können als ihre Quasi – Stationaritätsgrößen gesetzt werden

55 4.1. Modell von Sel´kov das System hat periodische Lösungen für einen gewissen Bereich von ν wegen der Sättigung, ist die Funktion f(σ 1, σ 2 ) durch 1 begrenzt falls ν > 1, sind die Lösungen der Differentialgleichungen nicht begrenzt

56 4.1. Modell von Sel´kov 0 < ν < 1 die Hauptisoklinen des Phasenflusses sind gegeben durch

57 4.1. Modell von Sel´kov für die stationäre Lösung gilt: die Stabilität der konstanten Lösung findet man durch Linearisierung der DGL´s der stationären Lösung und Prüfung der Eigenwerte des linearen Gleichungs- systems

58 4.1. Modell von Sel´kov das linearisierte System hat die Form: die charakteristische Gleichung für die Eigenwerte λ der linearen Gleichungssysteme ist Da f 1 immer positiv ist, ist die Stabilität des linearen Systems durch das Vorzeichen von H= αf 2 – η – f 1 betimmt es ist stabil für H 0

59 Wechsel der Vorzeichen, gibt es bei H = 0 dies sind Hopf – Bifurkationen periodischer Lösungen mit einer approximativen Frequenz H(0) = η(γ-1) H(1) = -η für γ > 1 muss es einen Hopf-Bifurkationspunkt geben, unter dem die konstante Lösung instabil ist 4.1. Modell von Sel´kov

60 für ν kurz unterhalb des Bifurkationspunktes, gibt es eine stabile periodische Bahn

61 4.2. Hess und Boiteux Hess und Boiteux (1973): es gibt für hohe und niedrige Injektionsraten eine stabile Stationaritäslösung es gibt zwei Hopf – Bifurkationspunkte 1. bei 20mM/hrDauer 8Min 2. bei 160mM/hrDauer 3Min

62 4.3. Goldbeter und Lefever sie schlugen 1972 Modell des Monod – Wyman – Changeux – Typs vor Annahme: PFK1 ist ein Dimer, das in zwei Stati existiert aktiven Status R inaktiver Status T S 1 kann an beide Formen gebunden werden S 2 (positiver Effektor des Enzyms) bindet nur an die aktive Form

63 4.3. Goldbeter und Lefever Die enzymatischen Formen, an die ein Substrat binden, zersetzen sich irreversibel, um ADP zu bilden das Substrat wir dem System in einer konstanten Rate geliefert die Rate der Rückbildung des Produkts verläuft proportional zur Konzentration

64 4.3. Goldbeter und Lefever T j = inaktive T-Form von der Enzymbindung zu j Substratmolekülen R ij = aktive R-Form des Enzyms, gebunden an i Substratmoleküle und j Produktmolekülen

65 4.3. Goldbeter und Lefever das Substrat S 1 hält das System im inaktiven Status durch Bindung mit T 0 um T 1 zu bilden S 2 hält das System im aktiven Status durch Bindung mit R 00 um R 01 zu bilden durch Bindung mit R 01 um R 02 zu bilden

66 4.3. Goldbeter und Lefever mit Hilfe des MWG erhalten wir die Differentialgleichungen der 14 Arten

67 4.3. Goldbeter und Lefever Annahme: die 12 Zwischenstufen sind im Quasistationaritäszustand lineares Gleichungssystem mit 12 Unbekannten und 12 Gleichungen es ist lösbar, wenn wir die Gesamtmenge der Enzyme e 0 setzen

68 4.3. Goldbeter und Lefever durch Substitution dieser Lösung in die Differentialgleichungen für s 1 und s 2 erhalten wir wir führen dimensionslose Variablen ein wir erhalten das System

69 4.3. Goldbeter und Lefever Falls wir außerdem annehmen 1. das Substrat bindet nicht an die T-Form (k 3 = 0, T ist komplett inaktiv) 2. T 0 wird R 00 gegenüber bevorzugt (k 1 >>k -1 ) 3. falls das Substrat S 1 an die R-Form bindet, wird die Bildung des Produkts S 2 der Trennung bevorzugt (k>>k -2 ) das System kann wesentlich vereinfacht werden f(σ 1, σ 2 ) = σ 1 (1 + σ 2 ) 2

70 4.3. Goldbeter und Lefever die Hauptisoklinen dieses Systems sind deutlich verschieden vom Sel´kov Modell die eindeutige Lösung für die Stationaritätsbedingung ist

71 4.3. Goldbeter und Lefever Die Stabilität wird wieder von der charakteristischen Gleichung bestimmt und das Vorzeichen des Realteils der Eigenwerte ist das selbe wie von ausgewertet unter Stationaritätsbedingungen sie kann auch geschrieben werden als Polynom dritten Gerades

72 4.3. Goldbeter und Lefever für genügend großes η hat das Polynom zwei Nullstellen, die größer sind als 2: y 1 und y 2 Annahame: die Flussrate ν ist proportional zur experimentellen Angebotsrate von Glucose Forderung: Am Hopf - Bifurkationspunkt, erhalten wir die Oszillationsperiode theoretisch T 1 /T 2 = 4,6 experimentell T 1 /T 2 = 2,7

73 4.3. Goldbeter und Lefever


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