SELDI-TOF Function and Reproducability

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1 SELDI-TOF Function and Reproducability
Von Gerrit Erdmann Betreuer: Benedict Brors

2 Was ist SELDI-TOF ? SLEDI-TOF: S urface E nhanced L aser D esorption/I onisation T ime o f F ilght Form der Massenspektroskopie Weiterentwicklung von MALDI-TOF Patent bei Ciphergen®

3 Wie Funktioniert SELDI-TOF
Abb.1 In NO-Laser gibt einen kurzen Laserpuls auf den Chip ab Proteine desorbiert und wird ionisiert während Matrix die Energie absorbiert Beschleunigung über E-Feld und Auftrennung nach Masse/Ladung (m/z) Quotient

4 Wie Funktioniert SELDI-TOF
Proteinchips mit verschiedenen vorbehandelten Oberflächen Ermöglicht es bestimmt Proteine anzureichern Abb.4 Abb.3 Abb.2

5 Einsatzgebiete von SELDI-TOF
Abb.5

6 Einsatzgebiete von SELDI-TOF
Biomarker Discovery Expression Difference Mapping TM Interaction Difference Mapping TM Antibody-Antigen Interaction DNA Protein Interaction Protein Purification Glycosylation Analyses uvm.

7 Beispiel eines SELDI-TOF Experiments
Untersuchung von Eierstockkrebs durchgeführt 2002 von Petricoin et al. „black box aproach“ 3 Messreihen insgesamt, 2 aber später 216 Serum Proben: 50 normal , 50 Krebs als Trainingsdaten verdeckte Proben (50 normal , 50 Krebs, 16 benigne) mit Ciphergen H4 Proteinchip, baseline-subtraction“ Die Proben von 1. aber mit einem WCX2 Proteinchip, baseline-subtraction Neue Proben. 91 normal 162 Krebs. Auftrennung in Trainingsdaten nicht angegeben

8 Die Durchführung Massen Auflösung ständig überprüft
Genauigkeit 0,1% Da als Zielgröße Positiv und Kontrollproben gleichzeitig, vermischt auf einem und mehreren Chips Serum von einer Normalprobe auf 100 verschieden Chips 9 davon zufällig für „Coefficient of Variance“ (CV) benutzt ( 8 Proteinpeaks)

9 Die Auswertung Normalisierung der Daten [0,1]
M/Z Werte mit einem Genetischen Algorithmus und Cluster Analyse untersucht Fitness Test ergibt Satz an „features“ der Trainigsdaten am besten trennt Anwendung auf die Verdeckten Daten mit 3 Kategorien „baseline-subtraction“ vermutlich erst nach Auswertung

10 Das Ergebnis für Messreihe 1
CV < 10% 63/66 der verdeckten Kontrollen (95%) richtig als nicht Krebs 16/16 benigne erkannt 50/50 als Krebs erkannt (auch Stage I) 100 % Sensitivität und 95 % Spezifität „positiv predictiv value“ 94 %

11 Überprüfung duch Baggerly 2004
Rohdaten nur für Messreihe 3 verfügbar, Messreihe 1 und 2 nur „baseline-substracted“ ( irreversibel, nichtlinear) Resultate nur für Messreihe 3 reproduzierbar

12 Ein Wechsel im Protokoll ?
In Messreihe 1, Erkennung aller 16 benignen wegen deutlicher Unterschiede In Messreihe 2 kein deutlichen Unterschiede wegen Ähnlichkeit der zwischen 1 u. 2 vermutlich Protokollwechsel

13 Daten „offset“ und Übertragung auf Messreihe 3
Abweichung bei M/Z Value von ca. 1% zwischen 2 und 3 Versuch der Korrektur „feature“ Sätze von 2 funktionierten nicht für 3 Ungekehrt sehr schwierig ; Hinweise auf Signalsättigung Abb.6

14 Fazit Perfekte Seperation von 3 möglich , aber im „Noise-bereich“, z.T. auch bei 1 und 2 sehr seltsam da kein biologischer Hintergrund Unterscheide in Vorbereitung der Proben Keine Generalisierung der „feature“ Sets z.T. Set nicht stabil genug für „baseline-substraction“ Massenkalibrierung unzureichend bei 3 Werkseinstellungen Protokollwechsel in Messreihe 1 Struktur Erkennung theoretisch möglich, Ergebnisse aber vermutlich nicht Verwertbar, gewisse „baseline-subtraction“ sinnvoll

15 Ausblick Verbesserung der Vergleichbarkeit auch zischen verschiedenen Studien vollautomatische, robotisierte Flüssigkeitshandhabung Verbesserung der des CV von ca. 45 % auf ca. 27% Einführung von „replicates“ Auswahl der Peaks SNR ≥ 1,25: CV 53,3 % SNR ≥ 2 : CV 26,4 % Einführung und kontinuierliche Überprüfung von standardisierten Versuchparametern Z.B.Trocknungszeitunterschiede von mehr als 25 min vor der Zugabe der Matrixmoleküle kann zu CVs von bis 67 % führen

16 Abbildungs- und Literaturverzeichnis
Abbildungensverzeihnis Abb.1: Abb.2: Abb.3: Abb.4: Abb.5: K. Baggerly et al. (2004) Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum: comparing datasets from different experiments Bioinformatics, 20, Literaturverzeichnis K. Baggerly et al. (2004) Reproducibility of SELDI-TOF protein patterns in serum: comparing datasets from different experiments Bioinformatics, 20, E. Petricoin et al. (2002) Use of Proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer The Lancet, 359, M. Aviado et al. (2005) Optimization and evaluation of surface-enhanced laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF MS) with reversed-phase protein arrays for protein profiling Clin Chem Med 43(2)