Southern- und Northern- Blot-Analysen Gk-Methodenseminar Erlangen, März 2007 Southern- und Northern- Blot-Analysen Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie Medizinische Klinik III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum

Übersicht: Blotting-Methoden Southern Southwestern Northwestern Northern RNA DNA Western Protein Migration Elektrophorese Transfer Blocksubstanz Block Spezifische Sonde bzw. Antikörper Nachweis Modifiziert aus Elelectrophoresis in Practice by Westermeier, 2nd Edition

Southern-Blot-Analyse Methode zum qualitativen (z.B. Größe) und quantitativen Nachweis spezifischer, immobilisierter DNA-Sequenzen Isolierung der DNA bzw. PCR-Amplifikation Restriktionsverdau isolierter DNA Agarosegelelektrophorese Transfer Hybridisierung mit spezifischer DNA-Sonde Signalentwicklung

Übersicht: Southern-Blot-Analysen Gewicht RNA or DNA Filterpapier Schwamm Migration Größen- Standard Gel Elektrophorese Puffer Membran Transfer Sonde hybridisiert mit komplementären Sequenzen Membran Filter im Gefrierbeutel Gel Autoradio-gramm Transferierte DNA/RNA Exponieren mit Röntgenfilm Hybridisierung mit spezifischer radioaktiven Sonde Markierung der Sonde Modifiziert aus Recombinant DNA by Watson et al., 2nd Edition

DNA-Isolierung und -Quantifizierung Proteinase K/Phenol-Methode Extraktion des Lysats mit Phenol und Phenol/Chloroform Zellen bzw. Gewebe in SDS-Puffer lysieren DNA Verdau der RNA mit RNAse A/T1 Präzipitation der DNA mit Na-Acetat und EtOH auf Eis oder -200C/12 hrs Phenol Verdau der Proteine mit Proteinase K/SDS Lösen der DNA in TE (10mM Tris pH=8.0 / 1mM EDTA)

Ionenaustauschchromatographie nach Qiagen + Lyse cells in SDS buffer with ProtK and RNAse Apply to Resin St - HindIII Sau3A Elute

Ausbeuten Quelle DNA (mg) 1 Säugetierzelle:  510-12 (= 5 pg) 106 kultivierte Zellen : 2.5-10 10 mg Maus-Leber: 10-15 300ml Blut: 1-10

µg/ml Nukleinsäure = OD260 x Umrechnungsfaktor Quantifizierung und Reinheit isolierter Nukleinsäuren Photometrische Konzentrationsbestimmung µg/ml Nukleinsäure = OD260 x Umrechnungsfaktor Umrechnungsfaktoren (für Küvette mit d = 1cm): ds-DNA: 1 OD260 Unit = 50µg/ml ssDNA: 1 OD260 Unit = 35µg/ml ssRNA: 1 OD260 Unit = 40µg/ml ss Oligonukleotide: 1 OD260 Unit = 20µg/ml Reinheit Gute DNA: OD260 / OD280 = 1.7 - 1.9 Gute RNA: OD260 / OD280 = 2.0 - 2.2.

Restriktionsenzyme Entdeckung und Eigenschaften Erkennen spezifische DNA-Sequenzen und schneiden entweder innerhalb (Typ II) oder außerhalb der Erkennungsstelle (Typ I) Ca. 3,000 Restriktionsenzyme mit ca. 230 Sequenzspezifitäten Hauptsächlich in Bakterien, aber auch in einigen Viren und Eukaryonten Host-controlled restriction modification bei Bakteriophagen (Luria, 1950) , Erste Sequenz-spezifische Typ I Endonuklease (Arber and Linn sowie Meselson and Yuan, 1968) Erstes Typ II-Restriktionsenzym Hind II (Smith und Kollegen, 1970) Nobelpreis für Medzin an Werner Arber, Hamilton Smith und Daniel Nathans (1978) Mit Entdeckung der RE begann der Start der Molekuarbiologie

Einige Beispiele von Typ II-Restriktionsenzymen KpnI 5´-GGTACC GGTAC-3´ C 3´-CCATGG C CATGG 3´ Überhang Isoschizomere Asp718I 5´-GGTACC G GTACC 3´-CCATGG CCATG-5´ G 5´ Überhang 5´-CCCGGG CCC GGG 3´-GGGCCC GGG CCC SmaI Blunt Isoschizomere XmaI 5´-CCCGGG C CCGGG 3´-GGGCCC GGGCC-5´ C 5´ Überhang BstEII 5´-GGTNACC G GTNACC 3´-CCANTGG CCANTC-5´ G 5´ Überhang

Mit der Entdeckung der Restriktionsenzyme begann die Entwicklung der Molekularbiologie. Sie ermöglichen die gezielte Herstellung von DNA-Fragmenten, die dann isoliert und zu neuen Konstruktionen zusammengesetzt werden können. Enzyme, die "sticky ends" erzeugen, sind dabei besonders hilfreich, da sich die überlappenden Enden leicht miteinander verbinden lassen. Für ihre grundlegenden Arbeiten zur "Entdeckung der Restriktionsenzyme und ihre Anwendung in der Molekulargenetik" bekamen Werner Arber, Daniel Nathans und Hamilton Othanel Smith 1978 den Nobelpreis für Physiologie oder Medizin.

Die Aktivität von RE wird in Units [U] angegeben Enzymatische Aktivität von Restriktionsenzymen Die Aktivität von RE wird in Units [U] angegeben 1U entpricht der Menge an Enzym, das 1 ug l Phagen-DNA (ca. 45kb) in 1 Stunde unter optimalen Temperatur- und Pufferbedingungen verdaut

Agarose-Gelelektrophorese Ethidiumbromid (EtBr)-Färbung Interkaliert zw. Basen Bindung ist proportional zur Fragmentlänge EtBr löst Fluoreszenz- löschung von eingestrahl-tem UV-Licht aus Fragmente orangerot (Empfindlichkeit: 1-2ng DNA) EtBr-Färbung elektrophorestisch aufgetrennter genomische DNA

Kapillar-Transfer Aufbau Wahl der Membran Nitro-zellulose Nylon Bindung hydrophob (backen) Kovalent (UV) Fragmente Denaturiert > 300bp denaturiert > 50bp Transfer Kapillar Elektro Sonden Alle v.a radioaktiv markierte Sonden Bindungs-kapazität Hoch gering Gewicht: ~250 g Glasplatte Whatman Papier Papiertücher Nylon Membran Whatman Papier-Brücke Gel Poröser Stein 10 x SSC 20xSSC

Spaltung der Phospho-Diesterbindung) Fragmentierung durch Säure- und Alkalibehandlung OH H+ Adenin Depurinierung durch Säure Spaltung der N-Glykosid-Bindung Probleme Nur Einzelstrand-DNA bindet an Membran Große DNA-Fragmente (> 10kb) transferieren schlecht -OH Denaturierung und Spaltung durch Lauge Spaltung der Phospho-Diesterbindung) 1. Fragmentieren 2. Denaturieren (modifiziert aus: Knippers, Molekulare Genetik)

Markierung der Sonde Sonden Prinzip Doppelsträngige (ds) DNA Einzelsträngige (ss) DNA Einzelsträngige (ss) RNA Oligonukleotide (20 - 50 Basen) Prinzip Verwendung markierter Desoxynukleotide während der Synthese bzw. Markierung fertig synthetisierter DNA und RNA-Fragmente sowie Oligos

Markierte Desoxynukleotide Biotin α γ 2 Biotin-7 -dATP a[32P]-dATP Digoxigenin Digoxigenin -dUTP (adapted from http://www.boku.ac.at/zag/ubungen.htm)

Markierungsmethoden ‚Random-Prime‘ ‚Nick-Translation‘ * * * Dnase I 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ dsDNA-Sonde dsDNA-Sonde 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ 1. 950C 2. Hexa-dNTP-Gemisch Dnase I 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 5‘ 3‘ Kornberg Pol (3‘-5‘ Exo) Klenow + aP*dNTP 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ * * * Kornberg Pol (Pol) + aP*dNTP Markierung * * * 5‘ 3‘ 3‘ 5‘

* * * * * 5‘ 3‘ ***3‘ 5‘ * * * * * * * * * * * * * Markierung In vitro Transkription 5‘-Endmarkierung 3‘ Tailing dsDNA- Sonde dsDNA- Sonde 5‘ 3‘ 5‘ 3‘ 3‘ 5‘ 3‘ 5‘ Vektor mit Sondensequenz + T7-Promoter 5‘-Kinase + gP*dNTP T7RNA-Pol + aP*NTP TdT + aP*dNTP * * * * * 5‘ 3‘ 5‘ 3‘*** 3‘ 5‘* ***3‘ 5‘ * * * * * * * * * * * * * Markierung

Spezifische Aktivität und chemische Konzentration z.B. 3000 mCi pro mMol Chemische Konzentration mMol pro liter Konsequenz: Setzt man 100 mCi eines 32P-markierten Fragments mit 3000mCi/mmol bzw. 300 mCi/mmol ein, so ist die chemische Konzentration des Fragments mit der höheren spezifischen Aktivität um das 10-fache geringer (Beispiel: Über Random-prime bzw. Nick-translation markierte Sonden)

der transferierten Nukleinsäure (UV oder 800C) Hybridisierung Gel Membran Fixieren der transferierten Nukleinsäure (UV oder 800C) Hybridisierofen Transferierte DNA/RNA Einfrierbeutel Markierte Sonde 1. Prähybdridisierung 2. Hybridisierung 3. Waschen

Nachweis der Hybridisierung Nachweis radioaktiv-markierter Sonden Verstärkerfolie Membran kb 23 9.4 6.6 Röntgenfilm 4.4 Autoradiogramm Belichten eines Röntgenfilms mit Verstärkerfolie Bei –700C

Einfluß der Temperatur Einfluß der Verstärkerfolie Ag+  Ag*  Ag *•Ag* t½=1sec  Zur Entwicklung von aktivierten Silber-atomen (Ag * ) während der Filment-wicklung benötigt man mindestens zwei aktivierte Silberatome. Bei niedrigen Temperaturen ist die Halbwertszeit des ersten aktivierten Silveratoms größer. Dadurch erhöht sich die Wahr-scheinlichkeit, dass ein zweites aktivier-tes Ag-Atom entsteht, bevor das erste Silberatom wieder reduziert wird Einfluß der Temperatur Einfluß der Verstärkerfolie Verstärkerfolie Röntgenfilm Membran Photon g-Strahlung

Nachweis nicht-radioaktiv markierter Sonden Kolorimetrisch Immobilisiertes Fragment Markierte Sonde Redoxreaktion mit reduziertem farblosen P-Substrat (z.B. NTB/BCIP-Reaktion) Biotin Digoxigenin AP Avidin AP Ak

Schematic of the NBT/BCIP reaction: when alkaline phosphatase (AP) removes the phosphate group of BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate) the resulting molecules dimerizes under oxidating conditions to give the blue precipitate (5, 5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo). During the reaction with BCIP, NBT (nitroblue tetrazolium) is reduced to its colored form to give an enhanced color reaction (adapted from http://www.boku.ac.at/zag/ubungen.htm: Kolloquiumsunterlagen, Molekularbiologische Übungen,

Chemilumineszenz Schematic of the CSPD reaction: Enzymatic dephosphorylation of the dioxetane CSPD by alkaline phosphatase leads to the metastable phenolate anion, which decomposes and emits light at 477 nm. (adapted from http://www.boku.ac.at/zag/ubungen.htm: Kolloquiumsunterlagen, Molekularbiologische Übungen, Gößl et al., Zentrum für Angewandte Genetik)

Anwendungen Verfizierung der Identität eines PCR Produktes bzw. DNA-Fragmentes Kartierung isolierter DNA-Fragmente Analyse von Intronsequenzen Nachweis von Genmutationen Nachweis von Genumlagerungen Nachweis der homologer Rekombinationen (gezielte Mutationen z.B. bei Mäusen)

Immunglobulin- bzw. T-Zellrezeptorgen-Umlagerungen Immunglobulin- bzw. T-Zellrezeptorgene werden durch Umlagerung von Gen-segmenten während der Reifung von B- und T-Zellen aus Blutstammzellen ge-bildet

Beispiel: Genumlagerung am Schwerkettengen-Lokus Sonde S B+/- B+/+ Kb 6 - 5- 4 - 3 - 2 - 1 - Sonde Eco-Verdau + Sonde

Beispiel: Nachweis gezielter Mutationen in transgenen Mäusen 7-kb wildtype fragment (JkW) Wildtype +/- +/- +/+ JkW (7.0) Pst I Jk Pst I Ck Wildtype locus 5’ Jk JkT (5.7) Pst I Pst I Targeted locus neo 5.7-kb targeted fragment (JkT) 5 6 7 8 Pst I digest 5’ Jk probe Aus: Kline et al, JI 1998

Nachweis gezielter Mutationen in Zellinien * * Wildtyp Klon 60 Klon 59 Klon 58 Klon 57 Klon 56 Klon 55 Klon 54 Klon 53 Klon 52 Klon 50 23,1 23,1 9,4 6,6 4,8 4,4 4,4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 EcoRI / Sonde A Aus: Dagmar Fuchs, Diplomarbeit 2001

Gendiagnostik Dia entnommen aus www.????

Northern-Blot-Analyse Methode zum qualitativen (z.B. Größe !!!!) und quantitativen Nachweis spezifischer, immobilisierter RNA-Sequenzen RNA-Isolierung Denaturierung Agarosegelelektrophorese Transfer Hybridisierung Signalentwicklung

RNA-Isolierung Eine eukaryontische Zelle enthält etwa 10 pg Gesamt-RNA ca 80 - 85% ribosomale RNA ca. 15 - 20% tRNA and snRNA ca. 1-5% mRNA Typische Ausbeuten (mg) 106 Hela : 15 106 COS-7 35 106 NIH/3T3 10 10 mg Milz 35 10 mg Hirn 8

Vorsichtsmaßnahmen Handschuhe tragen (Haut ist kontaminiert mir RNAsen) RNAse-freie Reagentien separat im Labor lagern Verwendung steriler Einwegmaterialien (Zellkultur) Glasswaren sollten bei 2000C gebacken werden Behandlung von deionisiertem Wasser mit 0.1% Diethylpyrocarbonat (DEPC, von Sigma) Gelkammern und andere Materielen für RNA-Arbeit reservieren Verwendung von RNase-Inhibitoren (Rnasin von Promega)

Guanidinium-Isothiocyanat Erfolgreiche RNA-Isolierung (4-Punkte-Regel) 1. Inaktivierung der RNAse-Aktivität 2. Effektiver Zellaufschluß 3. Denaturierung der Nukleoproteinkomplexe 4. Entfernung von Protein und DNA + NH2 - S-C N OH + CHCl3 2HN C NH2 Guanidinium-Isothiocyanat (GIT) Phenol / Chloroform Inaktiviert RNAsen Guter Zellaufschluß Zerstört Nukleoprotein- komplexe Zerstört Nukleoprotein- komplexes Extrahiert DNA und denaturierte Proteine

Isolierung von Gesamt-RNA 3 Lyse der Zellen bzw. Gewebe mit GIT/b-ME lysieren CsCl-Dichte-zentrifugation 2 1 DNA Extraktion des Lysats mit Phenol und Phenol/Chloroform Reinigen der RNA über Ionenaustauscher-Matrix (Qiagen, Promega) RNA Präzipitation der RNA mit Na-Acetat und EtOH auf Eis oder -200C/12 hrs Lösen der RNA in TE (10mM Tris pH=8.0 / 1mM EDTA) Lösen der RNA in TE (10mM Tris pH=8.0 / 1mM EDTA) Reinheit: OD260/280 = 2.0 - 2.2

Isolierung zytosolischer RNA Zellen bzw. Gewebe werden in nicht-ionischem Detergenz (NP-40, Triton X-100) lysiert RNA wird mit Na-Acetat und EtOH auf Eis oder bei -200C/12 hrs präzipitiert Kerne werden abzentrifugiert (Eppendorf, 13000g) RNA wird in TE gelöst (10mM Tris pH=8.0 / 1mM EDTA) Postnukleärer Überstand wird mit Phenol/Chloroform extrahiert Reinheit: OD260/280 = 1.8 - 2.0

Isolierung von Kern-RNA mRNA-Isolierung Zellen mit nicht-ionischen Detergenz aufschließen Zellen mit GIT aufschließen Kerne über Sucrose- gradienten aufreinigen Affinitätschromatographie an oligo(dT)-Matrix mRNA AAAAAA cap RNA über GIT-Methode und CsCl-Gradienten aufreinigen -TTTTTT Sepharose, Cellulose oder Magnet. Partikel Oligo-dT

Elektophorese und Transfer Analog Southern-Methode, RNA muss aber denaturiert werden Formaldehyd Verhindert Wasserstoffbrücken-bindungen zwischen Basen und somit die Ausbildung einer Sekundärstruktur Einzelsträngige, isolierte RNA-Transkripte besitzen viele, thermodynamisch-stabile Sekundärstruktur Denaturierte RNA-Fragmente haben keine Sekundärstruktur Scharfe Bande im Agarosegel Schmier im Agarosegel

Beispiel: Formaldehyd-Agarose-Elektrophorese verschiedener RNA-Fraktionen aus Hybridomzellen Gesamt-RNA = G mHC+/- Zytoplasma-RNA = Z Hybridom Kern-RNA = K mHC-Sonde Aktin-Sonde EtBr

Abbildung 2.9.2: Die beiden Methoden dienen dem Nachweis (und der Größenbestimmung) von spezifischer messenger-RNA oder Proteinen, die aus der Zelle isoliert wurden. (Northern.gif)