Anwendungen der PCR und von Hybridisierungstechniken Oliver Jahns Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 04/05

Inhalt Biochemische Anwendungen der PCR Molekularbiologische Anwendungen der PCR Medizinische Anwendungen der PCR Literaturnachweis

Biochemische Anwendungen der PCR Vermehrung von Material Verlust der Methylierung – Vermehrung von zellgiftigen DNA-Abschnitten

- Vermehrung von Material - PCR ist eine Alternative zur Vermehrung von DNA innerhalb lebender Bakterien bei bekannter DNA-Sequenz kann die PCR direkt, d.h. biochemisch zur DNA-Vermehrung eingesetzt werden

- Verlust der Methylierung – Vermehrung von zellgiftigen DNA-Abschnitten - eukaryontische DNA enthält oft 5-Methylcytidin (seltener andere modifizierte Basen) Modifizierungen dienen z.B. zur Promotorinaktivierung Klonierung von modifizierter DNA  prokaryontische Bakterienzelle kann diese DNA als Fremd-DNA erkennen und abbauen solche Bereiche lassen sich mit der PCR vermehren und direkt sequenzieren die Modifizierte DNA verliert die Modifikation und die gewonnene DNA lässt sich klonieren

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Molekularbiologische Anwendungen der PCR Quantifizierung der Genexpression Züchtung – Auslese vor der Aufzucht

- Quantifizierung der Genexpression - Regulation der Genexpression ist von wesentlicher Bedeutung für das Verständnis biologischer Vorgänge die Genexpression wird in einzelnen Zellen oder bestenfalls Zelltypen untersucht mittels Hybridisierung konnte die absolute Menge einer bestimmten mRNA bestimmt werden Nachteil: ermittelter Wert und tatsächliche Menge schwanken stark

Neue Möglichkeiten durch die PCR Einsatz von zwei spezifischen Primern für die zu messende mRNA zusätzlich zwei weitere Primer für eine Standard-RNA (Actin-mRNA, ribosomale RNA) Vergleich der beiden Produkte erlaubt eine relative Quantifizierung

- Züchtung – Auslese vor der Zucht - Tiere und Pflanzen lassen sich mit Hilfe gentechnischer Methoden züchten Nachteil: Aussagen lassen sich erst bei beim adulten Tier oder Pflanze treffen die PCR erlaubt eine Erfolgskontrolle schon im ganz frühen Stadium: wenige Zellen erforderlich einfache PCR mit zwei bekannten Primersequenzen aus dem Bereich der neueingebrachten DNA reicht aus

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Medizinische Anwendungen der PCR Diagnose von bakteriellen oder viralen Erkrankungen durch spezifische Primer Diagnose von Erbkrankheiten durch simultanen Gebrauch zweier Primerpaare Geschlechtsbestimmung mit Hilfe Y-spezifischer Primer

- Diagnose von bakteriellen oder viralen Erkrankungen durch spezifische Primer - DNA lässt sich anhand weniger Tropfen Blut, einer Gewebeprobe oder weniger Bakterienzellen nachweisen Voraussetzung: Ursache z.B. einer viralen Erkrankung molekularbiologisch ausreichend bekannt Heute: Standard-Primer für viele krankheitsverursachende Keime vorhanden routinemäßige PCR-Amplifikation dient zur Diagnose Agarosegel: Banden können dem Krankheitsbild zugeordnet werden

- Diagnose von Erbkrankheiten durch simultanen Gebrauch zweier Primerpaare - wichtiger Einsatz der PCR in der Pränataldiagnostik frühzeitige Erkenntnisse auf: - Träger einer Erbkrankheit - Überträger einer rezessiven Erbkrankheit - Erbgesundheit Punktmutationen oft für Erbkrankheiten verantwortlich

Neue Möglichkeiten der PCR Punktmutationen lassen sich durch die Verwendung dreier Primer direkt nachweisen Verwendung zweier verschieden fluoreszierender Primer Gegenprimer  gleichzeitige Amplifikation beider Primer gesunder Patient: Standardbande mit Standardfluoreszenz erbkranker Patient: Bande in identischer Höhe aber mit der anderen Fluoreszenzfarbe rezessiv gesunder oder dominant kranker Patient: Bande in identischer Höhe aber mit beiden Fluoreszenzen

- Geschlechtsbestimmung mit Hilfe Y-spezifischer Primer - in der Pränataldiagnostik lässt sich aus der Chromosomenanalyse auch das Geschlecht des Föten erkennen (langwieriger Prozess) mit Hilfe der PCR lässt sich ebenfalls das Geschlecht bestimmen (unkompliziert) zwei verschiedene Primerpaare werden verwendet: - Y-spezifisches Primerpaar - Primerpaar aus den sog. AluI-Elementen (zur Kontrolle) Methode wird wie eine Standard-PCR-Reaktion durchgeführt

Literaturnachweis Kröger,M. 1993. Biochemische, molekularbiologische und medizinische Anwendungen der PCR und deren methodische Grundlagen, Teil B: Biochemische Anwendungen der PCR. BIOforum, 16:250-256 Kröger,M. 1993. Biochemische, molekularbiologische und medizinische Anwendungen der PCR und deren methodischen Grundlagen, Teil C: Molekularbiologische Anwendungen der PCR. BIOforum, 16:288-293 Kröger,M. 1993. Biochemische, molekularbiologische und medizinische Anwendungen der PCR und deren methodischen Grundlagen, Teil D: Medizinische Anwendungen der PCR. BIOforum, 16:352-357