Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 04

Isolierung und Aufreinigung von Nukleinsäuren Nukleinsäureextrakion: Isolierung Reinigung Konzentrationsbestimmung Nukleinsäureextrakion genomischer DNA Nukleinsäureextrakion niedermolekularer DNA Analyse: Elektrophorese Färbung Zusammenfassung

Nukleinsäureextraktion Aufgereinigte Nukleinsäureextrakte Grundvoraussetzung der Nukleinsäureanalytik Verunreinigungen: Nukleasen, Nukleinsäuren anderer Art, Salze, Makromoleküle Grundsätzliche Verfahrensschritte: Isolierung Reinigung Konzentrationsbestimmung Analyse Verfahren abhängig von Species, Nukleinsäuretypus und weiterer Anwendung

1.1. Isolierung Isolierung genomischer DNA: Isolierung niedermolekularer DNA: Herkunft Eigenschaften Probleme Gewebe Zellkulturen Organismen (z.B. Bakterien, Hefe) Hochmolekular (>200 kbp) Zerstückelung durch Scherkräfte Verpackung (Histone, u.a.) Herkunft Eigenschaften Probleme Bakterien-Plasmide Hefe-Plasmide virale DNA extrachromos. DNA Niedermolekular (2-200kbp) oft zirkulär Verunreinigungen

1.1. Isolierung Aufschluss Proteindenaturierung mit Detergenzien, z.B. SDS durch Enzyme, z.B. Lysozym bei Bakterien Mechanischer Aufschluß Kochen Proteindenaturierung Proteinase K (Protease) chemisch: Phenolisierung, SDS, NaOH

1.2. Reinigung Phenolextraktion: Ausschütteln mit Wasser - Phenol: Phenol denaturiert Proteine, nach Zentrifugation: wässrige Nukleinsäurelösung – Proteine in Interphase oder Phenolphase Ausschütteln mit Wasser - Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol: stabilere Phasengrenze, gründlichere Denaturierung Phenolisierung wiederholen, bis Interphase sich nicht mehr bildet

Phenolextraktion:

1.2. Reinigung Gelfiltration „Molekularsiebeffekt“: große DNA-Moleküle dringen nicht in Gelporen ein – eluieren schneller als niedermolekulare DNA Fraktionierte Sammlung des Eluats

Ethanolpräzipitation: 1.2. Reinigung Ethanolpräzipitation: Ausfällung der Nukleinsäure mit Ethanol + monovalente Kationen Konzentrierungseffekt, waschen mit 70% Ethanol

1.3. Konzentrationsbestimmung Photometrische Konzentrationsbestimmung: Adsorptionsmaximum doppelsträngiger DNA bei 260 nm durch aromatische Ringe der Basen 50μg/ml doppelsträngige DNA hat Adsorptionswert von 1 (Vorraussetzung: 1cm Schichtdicke, Quarzküvette) Hyperchromie: einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle besitzen höhere Adsorption (1 OD260 entspricht 33 μg/ml RNA bzw. 40 μg/ml einzelsträngiger DNA) Konzentrationsbestimmung kurzer Oligonukleotide über Summe der Adsorptionskoeffizienten der einzelnen Basen Bestimmung der Reinheit: Messung OD260/OD280-Wert (1,8 = rein)

1.3. Konzentrationsbestimmung Ethidiumbromidanfärbung: bei geringen Nukleinsäuremengen: Bestimmung der Konzentration durch Ethidiumbromidanfärbung – Vergleich mit Verdünnungsreihe planare Struktur - interkaliert in die Nukleinsäure durch Interaktion der aromatischen/heteroaromatischen Ringe

2.1 Isolierung genomischer DNA Zellwandaufschluss und Proteinabbau Organismus Aufschluss Proteinabbau Eukaryotische Zellkulturen Natriumdodecylsulfat (SDS) Proteinase K Gewebe SDS / Proteinase K Pflanzen SDS oder N-Laurylsarkosin Hefe Zymolase oder Lyticase Bakterien Lysozym Proteinase K: Serinprotease, schneidet relativ unspezifisch, nicht hemmbar durch Ionen/EDTA, benötigt SDS

2.2: Reinigung genomischer DNA Molekülgrößen um 80 kbp: Aufschluss und Proteindenaturierung durch Guanidium-Hydrochlorid DNA-Isolation durch Ethanolfällung Anwendung: Southern-Blot, PCR Molekülgrößen 100-150 kbp: Phenolextraktion DNA an Phasengrenze Wasser-Phenol DNA-Entnahme durch Aufrollen auf steriles Stäbchen Anwendung: Southern-Blot, Genombanken mit Phage λ Molekülgröße > 200 kbp: Denaturierung von Proteinase K und Protein-DNA-Komplexen durch Formamid Dialyse in Collodion-Schläuchen → minimale Scherkräfte Anwendung: Cosmidbanken

3.1: Isolierung niedermolekularer DNA Anzucht: Mini- (<10ml), Midi- (<100ml), Maxi- Präparationen (>100ml Bakterienkultur) Steigerung der Plasmidausbeute durch selektive Amplifikation (Translationsinhibitoren) Aufschluss: Aufschlussart Lyse durch: Hintergrund alkalische Lyse SDS/NaOH schnell, low copy Kochlyse Lysozym/100°C Lithium-Methode LiCl/Triton X-100 <10 kbp SDS-Lyse Lysozym/SDS >15 kbp

3.1: Isolierung niedermolekularer DNA alkalische Lyse: EDTA, RNase, 95°C, SDS-Lyse, NaOH-denaturiert DNA Plasmid-Renaturierung durch Kaliumdodecylsulfat Abzentrifugation unlöslicher Komponenten Fällung mit Ethanol oder Isopropanol – waschen schnelle Methode – zum Austesten von Klonierungen Kochlyse: Lysozym, aufkochen, abzentrifugieren denaturierter Bestandteile DNA in Lösung, gegebenenfalls Phenolisierung der DNA gegen Endonuclease – Präzipitation

3.1: Isolierung niedermolekularer DNA Lithium-Methode: Triton 100X (Detergenz)/LiCl – Auflösung der Plasmamembran Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol denaturiert Proteine/Membranen Plasmid-DNA bleibt gelöst SDS-Lyse: Lyse durch SDS, partielle Fällung chromosomaler DNA durch NaCl nach Zentrifugation – Plasmide im Überstand geeignet für große Plasmide

3.2. Reinigung niedermolekularer DNA Reinigung über Anionenaustauschersäulen: negativ geladene DNA bindet an positiv geladenes Säulenmaterial (z.B. DEAE) degradierte Proteine/RNA binden nicht Auswaschen der DNA mit hohen Salzkonzentrationen

3.2. Reinigung niedermolekularer DNA Dichtegradientenzentrifugation: Zentrifugation in CsCl-Gradient + Ethidiumbromid liefert hochreine DNA Ethidiumbromid interkaliert stärker in lineare als zirkuläre DNA → Dichteunterschiede (Proteine: geringere Dichte, RNA pelletiert) Auswaschung: Ethidiumbromid mit n-Butanol, CsCl durch Dialyse

Analyse Wie groß sind extrahierte Nukleinsäuren? In welcher Konformation liegt Nukleinsäure vor? Sind eventuell transformierte Elemente eingebaut worden? Analyseverfahren: Auftrennung durch Gelelektrophorese Anfärbung

4.1: Analyse - Gelelektrophorese Trägermaterial: Agarose oder Polyacrylamid Nukleinsäuren negativ geladen (Phosphatgruppen) Verhältnis Ladung : Molekulargewicht ist konstant Trennung im Gel nach Molekülgrößen Ogston-Siebeffekt (globuläre DNA)/ Reptationstheorie (lineare DNA)

4.1: Analyse - Gelelektrophorese Auftrennung in Agarosegelen: Wanderungsgeschw. abh. von Agarosekonz., Spannung, Laufpuffer, interkalierenden Farbstoffen denaturierende Bedingungen um Sekundärstrukturbildung zu verhinden Trennung linearer, doppelsträngiger DNA: lineare Abh. von log Länge (bp) zu Wanderungsdistanz Trennung zirkulärer DNA: superhelical > linear > relaxiert →(Abb)

4.2: Analyse - Anfärbung Ethidiumbromid: SYBR Green/TOTO1/YOYO1: Anregung unter UV-Licht, Nachweisgrenze: 10-20 ng ändert Konformation zirkulärer DNA-Moleküle SYBR Green/TOTO1/YOYO1: Fluoreszenzfarbstoffe – sensitiver (binden mit höherer Affinität) und weniger mutagen als Ethidiumbromid Silberfärbung: extrem sensitiv: Nachweisgrenze 0,03 ng/mm², nicht mutagen - Reduktion von Silbernitrat zu reinem Silber Nachteil: zeitaufwendig, hohe Hintergrundfärbung

Zusammenfassung Nukleinsäureextraktion: Isolierung Reinigung Konzentrationsbestimmung Analyse Verfahren abhängig von Größe und Art der Nukleinsäure, Ausgangsorganismus und Verwendungszweck

The End!!