Immunologische Nachweismethoden Block „Molekularbiologische Arbeitstechniken“ 29.10.2004 Sandra Niemeier

Gliederung Antigene Antikörper Antigen-Antikörper-Reaktion Maus-Antikörper Antigene Antikörper Antigen-Antikörper-Reaktion Was passiert nach dem Protein-Blotting? Nachweisreaktion durch Antikörper Visualisierung

Einleitung Begriff der Antigene und Antikörper aus Immunologie Antikörper in Organismen von Vertebraten unterscheiden zwischen Eigen und Fremd; spezifische Abwehr von Pathogenen (Mikroorganismen, Viren) Wandelbares + adaptives Immunsystem Hohes spezifisches Bindungsvermögen als Nachweismethode für versch. Substanzen in Bioanalytik einsetzbar

Antigene Immunologie: Begriff definiert durch „passenden“ Antikörper; lösen Immunantwort aus Proteine, Polysaccharide, selten Glycolipide, synthetisch hergestellte Makromoleküle Teilbereiche auf Ag-Oberfläche reagieren mit Ak (Epitope, 5-8 Aminosäuren)

Antigene Voraussetzungen für Immunogenität: Chemische Differenz des Ag zum immunisierten Individuum (evolutionäre Distanz) Größe mind. bis 5-10 kDa (kleinere Peptide müssen gekoppelt werden) Zugänglichkeit der Epitope für Ak (durch Denaturierung teilw. zu verbessern) Potenz der Epitope bedingt durch Seitenketten der AS: polare + große Seitenketten sehr bestimmend

Antikörper Glycoproteine, sog. Immunglobuline Produziert von B-Lymphocyten ( => Knochenmark) Antikörperklassen Ig A, D, G, E, M IgG = 75% der Ak im Organismus meist gebrauchter Ak für Nachweisreaktionen leicht zu gewinnen aus Serum nach Immunisieren von Tieren gut löslich, bei 4ºC lange lagerbar kann mit anderen Substanzen kovalent gekoppelt werden Größe: 150 kDa

Antikörper 4 UE: 2 ident. leichte Ketten L 2 ident. schwere Ketten H Y-förmiges Molekül durch Disulfidbindung und nicht kovalente WW Antigen-Bindungsstelle besteht aus variabler Region der H- und L-Kette

Antikörper - Handhabung Problem: 1) Verlust der Antikörperaktivität Schädigung durch bakterielles Wachstum oder Aggregieren der Moleküle Lagerung bei 4ºC + Natriumazid Hinzufügen von 1% BSA Austrocknung durch Einfrieren Ak am stabilsten in Form von Antiserum Einfrieren kein Problem Austrocknen bei Einfrieren kleiner Mengen Röhrchen fest verschließen, Raum über Probe mögl. klein halten, T-Schwankungen vermeiden

Antigen-Antikörper-Reaktion Bindung durch van-der-Waals-Kräfte, hydrophobe + ionische WW, Wasserstoffbrückenbindungen Dissoziationskonstante 10-4 – 10-10 M (vergleichbar/größer als Enzym + Substrat) Antikörper meist divalent -> Bindung von 2 Antigenen

! Kreuzreaktionen mit Ak ausschließen Nachweisreaktion Wenn zu untersuchendes Protein auf Membran geblottet ist… Absättigen des Protein-Blots (Blocking): Um überschüssige Proteinbindestellen auf Membran zu sättigen Verhindert unspez. Bindungen der Nachweisreagenzien schwach gebundene Proteine können abgelöst werden Trocknen der Membran vor Auftragen d. Blocking-Reagenz Welche Lösungen? Nicht-ionische Detergenzien (Tween 20), nicht relevante Proteine (BSA), Proteinmischungen, Milchpulver, Kombis daraus ! Kreuzreaktionen mit Ak ausschließen

Nachweisreaktion 2) Bindung des Erst-Antikörpers Ak bindet an Protein auf Membran (nicht sichtbar) Inkubation 1-6 h bei RT oder üN bei 4ºC Gründliches Entfernen der Lösung (TBS) 3) Bindung des Zweit-Antikörpers an Erst-Antikörper Erforderlich zur Visualisierung Aus anderer Spezies als Erst-Antikörper Zweit-Antikörper an Enzyme, Radionuclide, Fluoreszenzfarbstoffe gebunden

Nachweisreaktion Verstärkung des Signals, da mehrere Zweit- Antikörper an Erst-Antikörper binden können Weitere Brückenmoleküle anlagern um noch größere Verstärkung zu erzielen (Dritt- oder Viert-Antikörper) Beispiel: Biotin-Avidin-Signalverstärkersystem Avidin bindet mit sehr hoher Affinität an Biotin am Zweit-Ak Avidin ist tetravalent, bindet 3 Enzymmoleküle Vervielfachung des Signals

Visualisierung 4) Geblottetes Protein mit gebundenen Antikörpern sichtbar machen Zweit-Antikörper trägt Radionuclid-/Fluorophormarkierung Direkte Visualisierung Radioaktiver Abfall Hoher apparativer Aufwand Radionuclide gut zur Quantifizierung geeignet (Visualisierung mit Röntgenfilm + Messung am Szintillationszähler)

Visualisierung B) Enzym-Markierung Indirekte Visualisierung Welche Enzyme? Meerrettichperoxidase (günstig, wenig sensitiv) Alkalische Phosphatase (hohe Sensitivität, aber teuer) Seltener ß-Galaktosidase ODER: Lichtemittierendes Produkt (Chemilumineszenz) 1 Enzymmolekül setzt viele Substratmoleküle um => Verstärkung Zur Quantifizierung nur eingeschränkt geeignet (Farbintensität schwer unterscheidbar)

Visualisierung Beispiel: Meerrettichperoxidase-System Zweit-Antikörper hat Meerrettich- Peroxidase gebunden Zugabe von 3,3‘Diaminobenzidin Umsetzung zu braunem Farbkomplex Photographieren, einscannen, bei RT im Dunkeln für kurze Zeit lagern

Danke für die Aufmerksamkeit! Das war‘s, Danke für die Aufmerksamkeit!