Grundlegende Techniken in den zellulären Neurowissenschaften

Präsentation zum Thema: "Grundlegende Techniken in den zellulären Neurowissenschaften"—  Präsentation transkript:

1 Grundlegende Techniken in den zellulären Neurowissenschaften
Färbetechniken

2 Übersicht Golgifärbung (Silberimprägnation) Nissl- Färbung
Immunzytochemie (Immunhistochemie) Tracer

3 Die Golgi- Färbung (=Silberimprägnation =Schwarze Reaktion)
1873 von Camillo Golgi entwickelt Nobelpreis 1906 für seine Untersuchungen der Struktur des Nervensystems Histologische Färbung mit Silbernitrat Schwarzfärbung Einzelne Nervenzellen und eine große Anzahl ihrer Fortsätze werden sichtbar gemacht Kein kontinuierliches Netzwerk sondern einzelne voneinander getrennte Zellen Camillo Golgi Verweis auf Praktikum : Dauerpräparate Lichtmikroskop

4 Mechanimus der Golgi-Färbung
Ammoniakalische Silbernitratlösung lagert sich an den Nervenfasern an Durch Zugabe von Formalin wird das Silbernitrat zu metallischem Silber reduziert  schwarzer Niederschlag auf den Fasern Mechanismus entspricht dem der Schwarz Weiß Fotografie . Formalin als Entwickler Nachteil der Methode: einzelne Nervenzellen werden unvorhersehbar angefärbt

5 Neuron im Kleinhirn, Mensch
Perikaryon Neuronen im Hippocampus BILD 1: reichentwickelter Dendritenbaum durch Färbung gut zu erkennen---Golgi macht alle morphologischen details sichtbar, sogar die Spikes auf der Oberfläche des Dendriten = Kontaktstellen mitPararallelfasern

6 Nissl-Färbung 1884 von Franz Nissl entwickelt
Histologische Färbung mit basischen Farbstoffen wie: Kresylviolett Touluidinblau Thionin Binden an basophile Verbindungen wie RNA und DNA Zellkern und Ribosomen werden angefärbt Verweis Touluidinblau  Praktikum Nachteil: Färbt nur Zellkern und Ribosomen und zwar in allen Zelltypen

7 Nissl-Schollen Bei der Nissl-Färbung werden nur das Perikaryon und der Zellkern angefärbt Nissl-Schollen werden sichtbar, entsprechen dem rauen endoplasmatischen Retikulum Nach Färbung unter Lichtmikroskop - Nissl Schollen werden sichtbar Am endoplasmatischen retikulum sind viele Ribosomen angelagert  Ribosomen aus RNA aufgebaut deswegen wird es durch Nissl Färbung sichtbar

8 Gesunde Nervenzellen in einem Hirnschnitt
Nervenzellen nach experimentellem Schlaganfall  irreversible Nervenschädigung

9 Immunzytochemie (Immunhistochemie)
Antikörpermarkierung der Transmitter oder transmittersynthetisierenden Enzyme Antikörper über Fluoreszierende Substanzen oder Enzyme markiert Selektive Dastellung von Nervenzellen mit bestimmten Transmittern Genaue Lokalisierung von bestimmten Strukturen Antikörper-Antikörper markiert -…tragen Enzyme oder fluorezierende Substanzen …sichtbarmachung von Strukturen in den Zellen.

10 Antikörper-Markierung
Direkt oder indirekt: Antigen Antikörper Reaktion ….dann wirkt Antikörper 1 wie Antigen für Antikörper 2 …trägt Fluorochrom oder Markerenzym

11 Jede Nervenzelle besitzt nur ein bestimmtes Transporter-Protein, das wiederum nur einen bestimmten Neurotransmitter transportieren kann. Kennt man also den Transporter, ist auch der Neurotransmittertypus der Nervenzelle identifiziert. Gegen die Transport-Proteine, verbleiben, sollen nun spezifische Antikörper entwickelt werden. Diese Antikörper, die an einen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt sind Nervenzellen mit Antikörper leuchten dann in der Zellkultur auf. Fünf verschiedene Nervenzellen-Typen sollen durch die neue Markierung unterscheidbar sein. Ausschnitt einer fixierten Nervenzelle (grün), die durch einen Antikörper gegen das Transportprotein vGlut 1 markiert ist.

12 Praktikum Immunperoxidase-Technik/ Die Avidin-Biotin-Methode
Primärantikörper erkennt Antigen Sekundärantigen gegen Primär und mit Enzym = Immunperoxidase ( Merettichperoxidase) gekoppelt nach Substratzugabe Kann durch Farbreaktion sichtbar gemacht werden VERSTÄRKUNG: Sekundärantikörper ist biotinyliert Avidin hat starke Affinität zu Biotin ..wird mit Peroxidase gekoppelt ….inkubiert  1 Aviding + mehrere Biotin  Substratlösung zugegeben  Farbumschlag Vorteil: sehr stark spezifisch

13 Tracer Eine künstliche, oft radioaktiv oder durch Fluoreszenz markierte körpereigene oder körperfremde Substanz Kann am Stoffwechsel teilnehmen (Untersuchung an lebenden Objekten) Dient der Untersuchung von Bahnverbindungen bei langen Axonen (z.B. beim Mensch, bis zu 1m lang)

14 Studie über die Hirndurchblutung bei einer Epilepsie-Kranken
mit dem Tracer 99mTc-HMPAO Während eines Anfalls Zwei Wochen nach dem Anfall Computertomographie – Beispiel für Untersuchung an einem lebenden Menschen Normalzustand Alzheimer

15 Retrograder Transport (Retrogrades Tracing)
von der Peripherie zum Perikaryon Ursprung eines Axons bzw. einer Bahnverbindung kann ermittelt werden

16 Anterograder Transport (Anterogrades Tracing)
Vom Perikaryon zur Peripherie Ende eines Axons kann ermittelt werden

17 Golgi-Färbung Nissl-Färbung Immunhisto-chemie
Perikaryon und Forsätze werden angefärbt Nur Perikaryon incl. Zellkern wird angefärbt Bahnverbindungen können ermittelt werden. Transmittertypen können bestimmt werden Färbung an dicken Schnitten Färbung an dünnen histologischen Schnitten Färbung bzw. Markierung an lebenden Objekten möglich