Transkriptomweite Expressionsanalysen an pulmonalen Nierenzellkarzinom-Metastasen Die Expressionsmuster pulmonaler Metastasen klarzelliger Nierenzellkarzinome spiegeln das krankheitsfreie Intervall sowie die Anzahl der Lungenmetastasen eines Patienten wider D. Wuttig 1, B. Baier 2, S. Fuessel 1, M. Meinhardt 3, S. Zastrow 1, C. Höfling 1, M.-O. Grimm 1, A. Meye 1, A. Rolle 2, M.P. Wirth 1 1 Klinik und Poliklinik für Urologie, Technische Universität Dresden 2 Fachkrankenhaus Coswig, Zentrum für Pneumologie, Beatmungsmedizin, Thorax- und Gefäßchirurgie 3 Institut für Pathologie, Technische Universität Dresden gefördert von der Dr. Robert-Pfleger-Stiftung

metastatic colonization Nierenzellkarzinom und Metastasierung Nierenzellkarzinom (NZK) dritthäufigster urologischer Tumor Dtl.: 10.000 Neuerkrankungen/Jahr [RKI, Stand 11/2004] urolog. Tumor mit höchster prozentualer Todesrate  Metastasen (60% der Patienten; 50-60% in Lunge)  medianes Überleben: 6–12 Monate Metastasierung metastasierungs-assoziierte Faktoren: Angiogenese, Zelladhäsion, Invasion, Migration metastatic colonization dormancy [http://www.nccr-oncology.ch] Einleitung

Zielstellung Zielstellung molekulare Faktoren, die mit Ausbildung variierender DFI und verschiedener Mets-Zahlen assoziiert (Microarray-Analysen) Untersuchung pulmonaler Mets (1318nm Nd-YAG-Laser, FKH Coswig) Hypothese Patienten mit frühen (synchronen) Mets sowie Patienten mit multiplen Mets haben extrem schlechte Prognose molekulare Ebene: „aggressivere“ Tumorherde (höhere Proliferationsrate, aktivierte Angiogenese, bessere Fähigkeit zu Anlagerung und Anwachsen in Sekundärorganen) Untersuchungsmaterial 20 kryokonservierte Lungen-Mets von 18 Patienten mit klarzelligem NZK homogenes Patientenkollektiv: Nephrektomie, keine anderen Tumoren, nur operative Therapien (außer 1 Pat.), klin. keine distanten Mets vor Lungen-Mets-Diagnose Zielstellung

Oligonukleotid-Microarrays: Methodik und Auswertung HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix), 47.400 Transkripte (38.500 Gene) Probenaufarbeitung Gewebeschnitte  RNA  cDNA  biotinylierte cRNA  Fragmentierung 25nt-Sonden auf Glasmatrix Hybridisierung und Waschen Scannen - Detektion via Phycoerythrin-markiertes Streptavidin (750 nm) - Fluoreszenzsignal  Transkriptmenge Auswertung (Software: RMAExpress) - globale Background-Korrektur, Quantil-Normalisierung - Signalberechnung, Logarithmieren (Pseudonormalisierung) - differenziell exprimierte Transkripte: Fold Change = MW Gruppe 1 / MW Gruppe 2 ≥ |1,8| (t-Test, FDR<0,05) Material & Methoden

Expressionsunterschiede bei unterschiedlichem DFI I Gruppeneinteilung: frühe vs. späte Metastasen DFI ≤9 Monate (0-9 Mon., Med=1 Mon.; n=5) vs. DFI 5 Jahre (60-156 Mon., Med=92,5 Mon; n=6)  306 differenziell expr. Transkripte („späte Mets“: 279, 27; 414 Sondensets) DFI ≤ 9 months ≥ 5 years Visualisierung: Principal component analysis, heat map (Auszug) DFI  5 years DFI ≤ 9 months Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse) Motilität / Migration der Zellen Zelladhäsion Angiogenese aktiviert in „späte Mets“ (z.B. KDR, PDGFB, PDGFA, PDGFRB, ETS1, CD31) Literaturrecherche lt. Literatur 73/306 (47%) metastasierungsassoziiert  75% in „späten Mets“ reguliert wie für Tumoren beschrieben  „späte Mets“ weisen höheres metastatisches Potential auf als „frühe Mets“ unerwartet, da Patienten mit „frühen Mets“ schlechtere Prognose haben Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

Tumorbiologische Ursache? 306 Gene (414 Sondensets)  Vorhersagemodell (k-nearest neighbouring) 8 Mets (DFI = 11 – 30 Monate) frühe Mets (DFI ≤ 9 Monate) späte Mets (DFI ≥ 5 Jahre) 1/8 Mets (DFI=15 Monate) 7/8 Mets (DFI=11 - 30 Monate) molekularen Unterschied zwischen synchronen und metachronen Mets  Theorie Primärtumor bei Mets-Wachstum noch anwesend und somit selbst in der Lage zur Metastasierung  metastatisches Potential der Mets gering Primärtumor bereits entfernt bei Beginn des Mets-Wachstums  Mets entwickeln von Beginn an höheres Metastasierungspotential Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

Expressionsunterschiede bei unterschiedlicher Mets-Anzahl I Gruppeneinteilung: wenige vs. viele Metastasen ≤8 (1-8, Med=3, n=10) vs. 16 (16-80, Med=24, n=7) Lungen-Mets/Pat. (klinisch: längeres Überleben für ≤9 vs. >9 Mets) [Rolle et al., J Thorac Cardiovasc Surg, 2006] 135 differenziell exprimierte Transkripte („viele MS“: 50, 85; 163 Sondensets) viele Mets wenige Mets Visualisierung: Principal component analysis, heat map viele Mets wenige Mets Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen

Biologische Relevanz der differenziell exprimierten Transkripte Biologische Prozesse (Gene Ontology-Analyse) Zellteilung und Zellzyklus (z.B. PBK, Survivin, PTTG1)  aktiviert in „viele Mets“ Grund für Unterschiede in MS-Anzahl sind möglicherweise verschiedene Wachstumseigenschaften der Tumorzellen Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen

Erstellung von Vorhersagemodellen Ausgangspunkt: Sondensets, deren differenzielle Expression mit zwei weiteren mathematischen Algorithmen validiert (GCOS, dCHIP) k-nearest neighbouring, weighted voting Vorhersagemodell zum DFI (11 + 1 Mets) 6-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation richtige Einordnung einer weiteren Proben Vorhersagemodell zur Metastasenanzahl (17 + 3 Mets) 11-Gen-Signatur: korrekte Leave-1-Out cross validation richtige Einordnung dreier weiterer Proben Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential Ergebnisse: Vorhersagemodelle

relativ zu fiktiver Probe mit DCP=0 Validierung der Microarray-Ergebnisse Expression von 6 Genen mittels quantitativer PCR validiert (TBP, DDCP) PTTG1 (pituitary tumor-transforming 1) GALNTL2 Array: Fold Change=2,1 p=0,002 relativ zu fiktiver Probe mit DCP=0 Überexpression Array: Fold Change=3,4 p=0,002 Fold Change=5,5 p=0,004* (n=6) (n=5) (n=7) (n=10) Fold Change=2,7 p=0,001* (n=11) (n=10) (n=8) (n=19) Fold Change=2,5 p=0,002* Fold Change=5,1 p=0,001* viele Mets wenige Mets späte Mets frühe Mets ( Median; * zweiseitiger t-Test basierend auf log2-Daten) Ergebnisse: Validierung

Zusammenfassung und Ausblick molekulare Unterschiede verschiedener Mets-Charakteristika:  verschiedene DFI spielgeln sich in unterschiedlichem metastatischen Potential der Mets wider  verschiedene Mets-Zahlen aufgrund variierendem Wachstumspotentials Expressionsprofile der Mets besitzen prognostisches Potential Ausblick Primärtumoren einbeziehen: Microarrays, Validierung (qPCR, Immunhistochemie)  prognostisch relevante Gensignaturen  Therapieregime anpassen

Expressionsunterschiede bei unterschiedlichem DFI II Top 10 *: Gen Transkriptbezeichnung Fold Change (spät/früh) p-Wert (t-Test) Funktion TNNT1 troponin T type 1 0,19 0,008 Schilddrüsen-Ca (Chromosomenaberration) PPM1H protein phosphatase 1H 0,32 S100A2 S100 calcium binding protein A2 0,35 NSCLC (); ass. mit Metastasierung XK X-linked Kx blood group (McLeod syndrome) MTAP methylthioadenosine phosphorylase 0,49 NZK (LOH), Magen-Ca (Deletion, Hypermethylierung) SFTPC surfactant, pulmonary-associated protein C 17,56 0,002 NSCLC (Deletion) PTGER3 prostaglandin E receptor 3 7,33 0,004 Kolon-Ca (); G-coupled receptor-Familie TSPAN7 tetraspanin 7, CD231 6,53 TSPAN2 (Zellmobilität, methyliert im Brust-Ca); TSPAN27 (Metastasierung) ADH1B alcohol dehydrogenase IB 11,95 Polymorphismen (Alkoholumsetzung) MYOCD myocardin 4,54 * based on t-Test (mean) Ergebnisse: frühe vs. späte Metastasen

Expressionsunterschiede bei unterschiedlicher Mets-Anzahl II Top 10 *: Gen Transkriptbezeichnung Fold Change (viele/wenige) p-Wert (t-Test) Funktion GPR64 G protein-coupled receptor 64 11,37 0,004 RASGEF1A RasGEF domain family, member 1A 4,63 0,006 Zellkultur (Gallengangkarz.)  Zellwachstum/-motilität PBK PDZ binding kinase 3,06 0,002 Burkitt´s lymphoma () E2F8 E2F transcription factor 8 2,68 0,008 E2F Familie (Regulation der Zellproliferation) ARNTL2 aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 2 2,10 Leber-Ca () SCGB1A1 secretoglobin, family 1A, member 1 (uteroglobin; CC10) 0,07 Zellkultur (NSCLC): TSG?; reguliert durch TITF1 TITF1 Thyroid transcription factor 1 0,24 Lungen-Adenokarzinome (gain) TMEM178 transmembrane protein 178 0,32 SCGB3A2 secretoglobin, family 3A, member 2 0,11 SFTPG surfactant associated protein G 0,14 * based on t-Test (mean) Ergebnisse: viele vs. wenige Metastasen

Metaanalyse MS vs. Primärtumoren (nicht-metastasiert, klarzellig) Publizierte Rohdaten zu Primärtumoren Lenburg et al. (2003) GEO accession number: GSE781 9 NZK Copland (2006) GEO accession number: GSE6344 10 NZK Ergebnisse 3000 potenziell MS-assoziierte Sondensets 31 Gene aus MS-spezifischer 128-Gensignatur [Jones et al., Clin Cancer Res 2005, 11: 5730. Ramaswamy et al., Nat Genet 2003, 33: 49.] 23 Gene aus Lungen-MS-spezifischer 94-Gensignatur [Minn et al., Nature 2005, 436: 518.] untersuchte Lungen-MS ähneln hinsichtlich ihrer Genexpression MS, die in anderen Studien untersucht wurden Ergebnisse: Metastasen-assoziierte Gensignaturen

Methoden (Software) „schlechte“ Chips aus Auswertung raus gelassen: 10, 21, 22, 24  restliche Chips (Anzahl:20) zusammen normalisiert (RMA, dCHIP) RMA GCOS (*.CHP-Daten) dCHIP Modell PM only PM-MM Background global lokal Normalisierung Quantile Linear (Scaling auf mittlere Intensität 500) invariant set normalization Identifikation differentiell exprimierter Transkripte: 1. FC cut-off RMA; log2(FC)|0,85| (FC1,8) 1011 Gene (269  in viele MS, 715  in wenige MS) log-Transformation  log2(FC)|1,5| (FC2,8) 1218 Gene (718  in viele MS, 500  in wenige MS)  log2(FC)|1,0| (FC2,0); p<0,05 (t-Test) 212 Gene (36  in viele MS, 176  in wenige MS) 2. t-Test  FDR (BH) p < 0,05 163 Gene (57  in viele MS, 106  in wenige MS) 391 Gene (228  in viele MS, 163  in wenige MS)

Algorithmus RMAExpress (robust multi-array analysis) Normalisierung: (Quantil-Normalisierung) Angleichen der Verteilung der Sondenintensitäten in allen Arrays Signalberechnung: i…Probe (Array) j…probe set (1…J) PM BG,N,log…Background-korrigiert, normalisiert, log-transformiert n…probe set - entspricht Transkript(variante) S…Signal j…probe affinity effect ij…unabhängiger Fehlerterm (Mittelwert über alle probe sets =0) (Vergl. GCOS: PM-MM für jedes probe pair  gewichteter Median)

t-Test-Korrektur für multiples Testen: False discovery rate (FDR) I t-Test: Irrtumswahrscheinlichkeiten  und   …falsch positive Ergebnisse (Typ I Fehler) … falsch negative Ergebnisse (Typ II Fehler) = 0,05 (5 %)  Wahrscheinlichkeit von 5 %, dass ich ein falsch pos. Ergebnis erhalte 1 Test (z.B. 1 Gen in zwei Proben)  mit einer Wkt. von 95 % ist das Gen wirklich diff. exprimiert, wenn es als signifikant verschieden (p<0,05) berechnet wurde 10 Tests (z.B. 10 Gene in zwei Proben) 1 – 0,9510 = 0,401 (40 %) Wkt., dass Test nicht falsch positiv klassifiziert wird mit einer Wkt. von 40 % ergibt mind. einer der 10 Tests eine falsch positive Antwort oder: 5 % von 1000 Genen (50 Gene) werden falsch positiv klassifiziert ( = 0,05)

t-Test-Korrektur für multiples Testen: False discovery rate (FDR) II verschiedene Ansätze, die Rate der falsch pos. Ergebnisse zu verringern: FWER (family wise error rate) Gesamtfehlerrate (bezogen auf alle Tests)  0,05 = multipel (erzeugt falsch negative  geringe Power) FDR (false discovery rate) (Benjamini & Hochberg) Gesamtfehlerrate (bezogen auf Tests mit pos. Ergebnis, also alle als diff. expr. klassifizierten Gene)  0,05 = multipel FDR = E (falsch pos/gesamt pos | R>0) . P(R>0)  5% FDR: 2,5 Fehler bei 50 als diff. expr. klassifizierten Genen Ergebnis: entweder Signifikanzniveau  oder p-Werte  GenePattern adjustiert p-Werte

Auswertung: Probenmaterial ld. Nr. Nephrektomie MS Anzahl MS uni-/bilateral Alter (Primärtumor) Lymphknotenstatus 1 1 Monat 44 (26 + 18) bilat. 65 negativ 2 1 Jahr + 3 Mon. 10 unilat. 62 ? 3 7-8 Jahre 18 (17 + 1) 58 4 1 Jahr 4 (2 + 2) 74 5, 6 1-2 Jahre 3 (2 + 1) 69 7 10 Monate 16 (10 + 6) 49 positiv 8 2 Monate 24 (11 + 13) 66 9 9 Monate 63 11 8 Monate 59 12 24 (9 + 15) 50 13 37 (21 + 16) 14 5 Jahre 15 13 bzw. 5 Jahre 6 (4 + 2) 16, 17 7 Jahre 8 (3 + 5) 18 11 Monate 80 (50 + 30) 64 20 9-10 Jahre 42 23 73 25 11 Jahre 5 (3 + 2) 57 Median  1 Jahr --- Gruppeneinteilung: Anzahl MS 8 vs. 16; Nephr.  MS 2 J. vs. 5 J.; uni- vs. bilat.

Vorhersagemodelle Metastasenanzahl: 11 Gene secretoglobin, family 1A, member 1 (uteroglobin) G protein-coupled receptor 64 Thyroid transcripytion factor 1 transmembrane protein 178 RasGEF domain family, member 1A E2F transcription factor 8 PDZ binding kinase surfactant associated protein G secretoglobin, family 3A, member 2 breast cancer membrane protein 11 Ets homologous factor Metastasen-freies Intervall: 6 Gene platelet/endothelial cell adhesion molecule (CD31 antigen) tropomyosin 2 (beta) heparan sulfate proteoglycan 2 tetraspanin 7 surfactant, pulmonary-associated protein C intercellular adhesion molecule 2

stark amplifiziertes Signal Arrayqualität Background sollte bei allen Proben gleich sein Scaling factor sollte max. um Faktor 3 variieren 3´/5´-Signal GAPDH % Present call Intensitätsverteilung über gesamten Chip (keine Hybridisierungsartefakte) keine Artefakte (Probe 1) stark amplifiziertes Signal (Probe 10) Intensitätsartefakt (Probe 22)

Expressionsunterschiede bei unterschiedlichem MSFI I ursprüngliche Gruppeneinteilung: MSFI ≤ 2 Jahre (12 Proben) vs. MSFI  5 Jahre (6 Proben) (klinisch: kürzeres Überleben von Patienten mit MSFI < 2 Jahre als mit MSFI > 2 Jahre [van der Poel et al., Eur Urol 1999, 35: 197.]  645 differentiell exprimierte Transkripte (lang: 514, 131) Visualisierung: Principal component analysis MSFI ≥ 5 Jahre MSFI ≤ 2 Jahre Subgruppenvergleich: frühe vs. späte Metastasierung